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盐霉素衍生物SAL-98的抗肿瘤机制研究

段文芳  
【摘要】:恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的常见疾病,其发病率和死亡率呈上升趋势。据估计,2020年将有超过180万新的癌症病例被诊断出来。近年来,尽管在诊断以及肿瘤治疗方面取得了一定的进展,但是,如何精准和高效地抗击肿瘤依然是一大难题。盐霉素(Salinomycin,SAL)是一种从白色链霉菌属中提取的羧基聚醚类钾离子载体抗生素,其过去常常被用作抗球虫药。最近的研究表明,盐霉素能够高选择性杀死人乳腺癌肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC),其效力比紫杉醇高100倍。盐霉素靶向作用CSC的作用促进了研究者将其进一步开发成为一种新型的抗肿瘤药物。虽然已经报道盐霉素具有很好的抗肿瘤作用,但是盐霉素还存在诸多问题,如:盐霉素的溶解性低;盐霉素虽然具有良好的抗肿瘤活性,但其容易出现显著的神经毒性。为了提高盐霉素抗肿瘤作用的选择性和提高其溶解性以及降低毒副作用,有必要开发新型盐霉素衍生物来提高抗肿瘤活性。在本研究中,由中国医学科学院协和药物研究所吴松教授课题组合成了一系列的盐霉素衍生物,我们首先采用MTT方法筛选了Salinomycin及其盐霉素衍生物SAL-77、SAL-79、SAL-81、SAL-96、SAL-98、SAL-106和SAL-107等化合物对一系列肿瘤细胞株如人结肠癌细胞SW620、SW480、HT29、HCT116、DLD-1和LOVO,人肝癌细胞Huh-7、Hep G2、MHCC97H和HCCLM3,人胃癌细胞KATOIII、MKN-45、BGC-823、NCI-N87和SGC-7901,人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7,人前列腺癌细胞PC-3以及正常细胞W2的抗肿瘤作用,发现一些盐霉素衍生物比盐霉素具有较高的抗肿瘤活性,其中SAL-98的抗肿瘤活性较好,尤其是对人结肠癌细胞HT29和人肝癌细胞Huh-7有明显的抑制作用,其IC_(50)值分别为0.039μM和0.042μM,而盐霉素对HT29和Huh-7肿瘤细胞的IC_(50)值分别为0.283μM、0.36μM,SAL-98的活性明显高于盐霉素的活性,大约是7倍,因此选择SAL-98做进一步的抗肿瘤机理研究。我们检测了盐霉素衍生物SAL-98对HT29和Huh-7细胞的细胞周期情况,发现0.05μM和0.1μM SAL-98处理6h、12h、24h后,HT29和Huh-7细胞发生G1期阻滞,并且经过检测发现凋亡相关蛋白Caspase-9、Bax在经SAL-98处理之后表达增加,Bcl-2降低,并且Annexin-V结果显示SAL-98可以引起HT29和Huh-7细胞发生凋亡。0.05μM和0.1μM SAL-98处理HT29细胞3h、6h、12h后,线粒体膜电位逐渐降低。同时,0.05μM和0.1μM SAL-98处理HT29细胞6h、12h、24h,可以使HT29细胞产生ROS。接下来,经过0.05μM和0.1μM SAL-98处理HT29和Huh-7细胞6h、12h、24h之后,发现自噬相关蛋白LC-3和p62的表达增加。我们通过检测发现在HT29和Huh-7中经0.05μM和0.1μM SAL-98处理6h、12h、24h之后PERK、CHOP、ATF4等内质网应激蛋白的表达增加,说明SAL-98能够产生内质网应激。为进一步研究SAL-98使细胞产生自噬是否通过内质网应激,我们联合内质网应激抑制剂4-PBA处理细胞后,检测发现自噬相关蛋白LC-3和p62表达均降低。有研究报道盐霉素能够选择性靶向杀伤乳腺癌干细胞,因此,我们发现0.1μM SAL-98可以降低HT29细胞的成球能力,并且相关肿瘤干细胞的标志物CD24、CD133、ABCG2和KLF4的表达均降低,初步说明SAL-98对肿瘤干细胞有影响。肿瘤微环境是肿瘤发生发展的场所(Tumor microenvironment,TME),其中包括肿瘤干细胞、肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)和间充质干细胞等,而TAM是炎症细胞中的一员,是肿瘤微环境中重要组成部分。M2型肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的血管生成、肿瘤生长以及转移过程中扮演着重要的作用。我们研究了SAL-98对TAM的作用,当加入不同浓度的(0.05μM和0.1μM)SAL-98之后,M2型巨噬细胞的标志物CCL5、CCL22以及CD206的表达明显降低,说明SAL-98可以抑制M2型巨噬细胞的极化。同时,TAM在癌症的转移中发挥着重要的作用,而M2型巨噬细胞的条件培养基可以促进肿瘤细胞的增殖,在经过M2型巨噬细胞条件培养基和0.05μM SAL-98共同处理HT29细胞后,发现SAL-98可以减少HT29细胞的迁移和侵袭能力。为了验证SAL-98的体内抗肿瘤作用,我们采用HT29细胞裸鼠移植瘤模型,按照1*10~6个细胞皮下注射,在注射24h之后再分别用1mg/kg SAL-98、5mg/kg盐霉素、5mg/kg 5-Fu每天腹腔给药,经过30天之后发现1mg/kg SAL-98可以抑制肿瘤的生长,抑瘤率为32.1%。WB的结果显示SAL-98给药后,体内肿瘤中LC-3、p62、ATF4、CHOP、PERK、Bip、Beclin-1的表达增加,表明SAL-98可以促进肿瘤组织的自噬以及内质网应激的产生。同时,免疫组化的结果显示SAL-98给药后,体内肿瘤中LC-3B的表达明显增加和CD44的表达降低。综上所述,我们研究发现SAL-98具有广谱抗肿瘤作用,可以诱导肿瘤细胞发生细胞周期阻滞、产生ROS、线粒体膜电位降低和诱导凋亡,可以诱导产生自噬以及内质网应激等发挥抗肿瘤作用。同时,SAL-98降低了肿瘤干细胞成球能力和降低了干细胞因子的表达,并抑制了M2型巨噬细胞的极化作用。


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