p16~（INK4a）调控DNA损伤修复和线粒体生物合成影响Werner综合症小鼠衰老进程的分子机制研究

【摘要】：衰老是一个自然过程,在这个过程中生物体的结构完整性随着时间的推移逐渐下降,导致生物体功能的下降和有机体死亡的风险增加。衰老本身已成为现代世界几乎所有发病和死亡的主要诱因中最大的危险因素,努力揭示衰老生物学的分子机制,并深入了解延缓衰老和促进衰老的潜在干预措施有利于衰老相关疾病的诊治。Werner Syndrome(WS)是由Wrn基因突变引起的一种常染色体隐性遗传病,其患者临床症状表现为衰老相关白内障、骨质疏松、皮肤溃烂、生殖系统功能低下等,平均寿命仅为46-48岁。通过敲除Wrn和端粒酶的RNA模版Terc构建的WS小鼠模型为衰老和衰老相关疾病的研究提供了很好的研究体系。p16~(INK4a)(简写p16,INK4a基因编码)是细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)抑制剂家族成员,调控细胞周期、肿瘤发生、细胞衰老、凋亡。为了研究p16在WS小鼠中的调控机制,前期通过p16敲除(p16~(-/-))小鼠与WS小鼠(m TR~(-/-)Wrn~(-/-),double knock out,DKO)杂交,得到纯合的m TR~(-/-)Wrn~(-/-)p16~(-/-)小鼠(triple knock out,TKO,p16-TKO),进而通过连续杂交获得了不同代数的小鼠(G1-G5)。在前期的研究中发现,p16敲除(p16-TKO)的小鼠与WS(DKO)小鼠相比,寿命明显延长,通过检测骨密度发现,骨质疏松症状得到缓解,高增殖器官如小肠、睾丸结构完整。与此同时,通过检测小鼠组织增殖与凋亡,发现p16-TKO小鼠增殖能力较强。通过进一步研究发现,p16参与维持了端粒的完整性。为了进一步研究p16调控WS衰老进程的分子机制,本研究从DNA损伤修复以及线粒体合成通路的角度进行了探索。首先,我们通过免疫荧光实验检测了DKO和TKO细胞中DNA损伤标记物γ-H2AX的表达情况,结果发现在G5DKO细胞中存在大量的γ-H2AX信号,而p16-G5TKO细胞中γ-H2AX信号显著降低。这提示我们,端粒功能异常导致大量的DNA损伤产生导致细胞衰老。敲除p16可以明显缓解DNA损伤信号的累积,提示p16介导了DNA损伤导致的细胞衰老。随后,我们通过Western blot检测了p53、MDM2、p21、损伤修复蛋白(Rad51、RPA、pol E)、凋亡(Bax、PARP)和增殖相关蛋白(PCNA)的表达。结果显示,在p16-G5TKO细胞中,γ-H2AX表达相对于G5DKO细胞中显著下降,总p53蛋白的表达增加,乙酰化以及磷酸化水平下降,p19和MDM2表达下降,这些数据提示在p16缺失时,p53转录活性降低,DNA损伤应激水平降低,与此同时,细胞启动了较强的DNA修复途径,体现为pol E、Rad51、RPA蛋白表达水平上升,PARP、Bax凋亡相关蛋白表达水平下降,PCNA增殖水平蛋白表达升高。因此,p16敲除后的这些分子调控可能是缓解WS小鼠衰老症状的原因。线粒体功能的完整性关乎到细胞命运,我们通过流式细胞仪检测了细胞中线粒体的数量。结果发现DKO细胞中线粒体的数量显著降低,而敲除p16后的TKO细胞中线粒体数量未发生显著的降低;通过Real-time PCR检测了线粒体基因组中CYTB、COX1、ND1的拷贝数,发现G5DKO细胞中线粒体基因组拷贝数明显减少,而p16-G5TKO细胞中拷贝数较WT细胞中没有明显的变化,这些数据表明p16功能缺失能够有效地缓解WS小鼠MEF细胞中线粒体数量的减少。接下来,我们检测了线粒体膜电位,结果发现p16-G5TKO细胞中线粒体的质量明显升高。紧接着,我们通过检测了线粒体ATP产量,发现敲除p16后,p16-G5TKO细胞中线粒体相比G5DKO细胞中线粒体产生较多的ATP。同时,我们通过检测SIRT1、PGC-1α、FOXO3等线粒体生物合成相关蛋白的表达量,同样的证明了在p16-G5TKO中发生上调。以上数据说明,WS细胞中p16的表达抑制了线粒体的生物合成,导致细胞代谢缓慢使得细胞发生衰老,敲除p16则可恢复线粒体的生物合成,缓解WS衰老症状。干细胞通过独特的自我更新和分化能力促进组织动态平衡和再生。我们通过流式细胞仪检测了小鼠骨髓中HSC(Hematopoietic stem cell)的含量,我们发现,G5DKO 2月龄的小鼠中HSC的含量较同月龄的p16-G5TKO小鼠低很多。这个现象说明敲除p16可以缓解WS小鼠体内干细胞衰竭的现象,提示p16参与了干细胞的稳态调节。综上所述,本研究表明,在WS的背景下敲除p16可以降低p53的活性,降低细胞中DDR,增强DNA损伤修复能力,减少细胞凋亡,增强细胞增殖能力。同时,通过激活SIRT1-PGC-1α通路,提高线粒体质量与数量,增强细胞能量代谢,抑制细胞衰老。本研究初步探索了p16调控WS细胞衰老的分子机制,为进一步的抗衰老抗肿瘤策略提供新的思路和靶点。