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MAPK信号传导通路的调控对皮肤光老化的保护作用研究

刘垠  
【摘要】:目的研究UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞后,细胞形态变化及相关细胞因子变化,检测MAPK信号传导的始动受体EGFR的表达情况,及MAPK信号途径中的下游基因c-jun,c-fos的表达变化。通过筛选出高效特异的c-junsiRNA后,对UVA照射后的皮肤成纤维细胞进行转染,探讨下调MAPK下游的基因c-jun对皮肤光老化中的MMPs,胶原的影响。 方法:1.取年轻成人包皮成纤维细胞培养传代,用第5代细胞做实验对象,进行细胞分组,采用不同计量的UVA(5 J/cm2、10J/cm2、20J/cm2)照射,设立对照组(0J/cm2),建立成纤维细胞光老化模型,培养24h后,光镜及电镜下观察细胞形态,RT-PCR及酶联免疫法(ELISA)测定照射前后体外培养的皮肤成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达及蛋白表达。MTT法测定细胞活性。2.采用UVA(5 J/cm210J/cm2,15J/cm2)照射,设立对照组,照射后24小时用realtimePCR检测MAPK信号传导途径下游基因c-jun,c-fos,及终末基因MMP-1,MMP-3的mRNA表达情况。酶联免疫法(ELISA)测定细胞上清液中的MMP-1,MMP-3表达,weasternblog检测c-jun, c-fos的表达。3.针对前期实验中c-jun随照射剂量依赖性增高,设计5条c-junsiRNA, realtimePCR,及westembolg从基因层面和蛋白层面对其筛选,筛选出沉默效率最高的c-junsiRAN,并优化转染条件。4。以15J/cm2辐射剂量照射体外培养的成纤维细胞,2小时后转染c-junsiRNA,转染后24小时,realtimePCR检测MMP-1、MMP-3 mRNA,Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA,48小时后酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中MMP-1、MMP-3,Ⅰ、Ⅲ型前胶原含量。5,以(5 J/cm2、10J/cm2、20J/cm2)照射成纤维细胞,设立对照,检测MAPK信号传导通路的始动受体EGFR的表达情况,检测TGF-β1、IGF-1、KGF、VEGF几个细胞因子在照射前后的变化. 结果:1.随着UVA照射剂量增加,成纤维细胞MTT的OD值下降,与对照组比较,UVA 10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组OD值明显下降,有显著性差异(p0.01)。Ⅰ型(?)mRNA RT-PCR产物积光吸光度随着UVA照射剂量增加而降低,UVA 10 J/cm2、UVA20J/cm2照射组降低明显(p0.05,P0.01),UVA 20 J/cm2组抑制胶原合成作用更加明显,与对照组及其它两组比较,有非常显著性差异(P0.01)。Ⅲ型胶原含量和mRNA表达,与对照组比较,UVA 20 J/cm2照射组明显降低,有非常显著性差异(P0.01)。细胞上清液中Ⅰ型胶原含量随着UVA照射剂量增加而降低,呈剂量依赖关系。UVA 10J/cm2、UVA 20J/cm2照射组,Ⅰ型胶原含量明显降低,与对照组比较(P0.05, P0.01),说明成纤维细胞分别给予UVA 10J/cm2、UVA 20J/cm2照射剂量,均可以抑制胶原合成,且剂量UVA 20 J/cm2组抑制胶原合成作用更加明显,与对照组及其它两组比较,有非常显著性差异(P0.01);而5 J/cm2剂量组与对照组比较,无显著性差异(P0.05)。Ⅲ型胶原含量,与对照组比较,UVA 20 J/cm2照射组Ⅲ型胶原含量明显降低,有非常显著性差异(P0.01),说明成纤维细胞在UVA 20J/cm2照射剂量后,能明显抑制胶原合成,而UVA 5 J/cm2、UVA 10 J/cm2剂量组与对照组比较,Ⅲ型胶原含量无显著性差异(P0.05)。2.随着UVA照射剂量增加,成纤维细胞c.junmRNA表达增加,与对照比较有显著差异,(p0.01)。c-fosmRNA各组无差异(P0.05)。MMP-1、MMP-3随着照射剂量增加mRNA表达也增加,有显著差异。蛋白表达也呈现出与基因表达的一致性。C-jun随着照射剂量增加而增加,各组间差异p0.01,而c-fos表达无明显变化(P0.05)。3,设计出5条c-junsiRNA,经realtimePCR,及westembolg从基因层面和蛋白层面共同对其筛选出沉默效率最高的c-junsiRAN,沉默效率大于80%。序列为:GCAUUCUUGUCACAAUAAATT。4,以15J/cm2辐射剂量照射体外培养的成纤维细胞,2小时后转染c-junsiRNA,转染后24小时,MMP-1、MMP-3 mRNA,与对照组(转染阴性序列组)相比mRNA表达下调,其中MMP-1(P0.01)、MMP-3(P0.05)。Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA,相比对照组(转染阴性序列组)Ⅰ型前胶原(P0.01),Ⅲ型前胶原(P0.05)。48小时后酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中MMP-1、MMP-3,Ⅰ、Ⅲ型前胶原含量也呈现出与mRNA表达一致的结果MMP-1(P0.01)、MMP-3(P0.05)、Ⅰ胶原(P0.01)、Ⅲ型胶原(P0.05)。5.UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞EGFRmRNA与蛋白表达呈现一致性,均随照射剂量增高而增高,5 J/cm2(p0.05),10J/cm2、20J/cm2(P0.01)。UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞导致TGF-β1、IGF-1、KGF分泌下降, UVA 10 J/cm2、UVA 20 J/cm2照射组明显下降,与对照组比较,有显著性差异(P0.01)。VEGF分泌升高,UVA 20 J/cm2照射组与对照组比较,有非常显著性差异(P0.01)。 结论:1.UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致细胞衰老,增殖活性下降;对Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成有抑制作用。2.UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞激活MAPK信号传导通路,其下游基因c-jun上调明显,c-fos变化不大,其终末基因MMP-1、MMP-3均上调。3.经realtimePCR,及westernbolg从基因层面和蛋白层面共同对5条c-junsiRNA筛选,筛选出沉默效率最高的c-junsiRAN,沉默效率大于80%。序列为:GCAUUCUUGUCACAAUAAATT,名称为JUN-h-825。4.UVA照射体外培养的成纤维细胞2小时后,经c-junsiRNA转染后的成纤维细胞,一定程度上MMP-1,MMP-3可以逆转下调,Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成减少的趋势也得到减轻。5.UVA照射后体外培养的皮肤成纤维细胞,EGFR表达明显增加,细胞上清液中的的细胞因子,TGF-β1、IGF-1.KGF分泌下降;VEGF分泌升高。


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