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自体诱导性多能干细胞移植治疗慢性肾功能不全的研究

周敬  
【摘要】:目的:1.体外培养外周血单个核细胞,并用本实验室创制的天然活性物质作为诱导剂,诱导单个核细胞逆向分化为诱导性多能干细胞(induced multiple stem cells, iMSc),同时对其进行鉴定;2.采用单侧输尿管结扎的方法建立以肾间质纤维化为特点的慢性肾功能不全的动物模型;3.自体诱导性多能干细胞体外BrdU标记后移植治疗慢性肾功能不全,通过多种方法对iMSc的治疗效果进行综合评价。最终目的是探讨iMS细胞移植治疗慢性肾功能不全的疗效,为慢性肾功能不全的治疗提供新途径和技术方法。方法:1.兔慢性肾功能不全模型的建立及实验分组:30只普通级日本大耳白兔,将动物按体质量编号后,按随机数字表分为两组:正常对照组(n=10):不做任何处理的健康兔做为对照;单侧输尿管结扌(?)(unilateral ureteral obstruction, UUO)组(n=20):行左侧输尿管结扎术。将UUO组结扎干预8周后,行左侧输尿管再通术,再将UUO组分为两组:干细胞治疗组(n=10):对该模型组的动物进行自体干细胞移植治疗;模型对照组(n=10):不做任何治疗2.自体外周血单个核细胞的体外培养、诱导及鉴定:本实验采用聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque, F-H)分层液密度梯度离心法,从外周血中分离得到单个核细胞,分为两组,诱导组:用实验室自制的诱导剂,按照实验室的方法,给予一定的比例,诱导培养72小时;对照组:不添加诱导剂,用含10%小牛血清的DMEM/F12培养基体外培养72小时。用免疫组织化学法、半定量反转录—聚合酶链反应法(SqRT-PCR)测定诱导后的细胞Oct3/4、Nanog基因的表达水平3.自体诱导性多潜能干细胞体外标记:BrdU标记移植的iMS细胞4.移植及治疗效果评价:分别对正常对照组与UUO组进行比较,可评价模型的建立,再对干细胞治疗组和模型对照组进行比较。随机抽取各组兔从耳缘静脉采集外周血,分析血肌酐及尿素水平,SPECT监测肾小球率过滤及肾血流状况,取肾脏组织用SqRT-PCR测定肾脏组织中肾间质纤维化相关的转化生长因子(TGF-β1)的相对含量,用免疫组织化学法分析TGF-β1的表达量,并留取肾脏组织做超薄切片,通过HE染色及透射电镜观察结构的改变,对iMSc的治疗效果进行综合评价。结果:1.诱导组细胞诱导培养72小时后,干细胞标志基因Oct3/4、Nanog有表达,对照组即没有添加诱导剂培养的细胞无上述两种基因的表达2.UUO组血肌酐、尿素氮水平与正常对照组比较明显升高(P0.01);干细胞治疗组血生化水平比模型对照组明显降低3.UUO组肾小球滤过率GFR及肾脏血流比正常对照组显著降低,干细胞治疗组与模型对照组相比,肾小球血流量有增加4.UUO组TGF-β1的表达比正常对照组明显增加,(P0.01),干细胞治疗组与模型对照组相比,TGF-β1的表达有一定程度的下降(P0.05)5.肾脏病理组织观察UUO组肾脏组织结构紊乱,间质有明显的纤维化,干细胞治疗组与模型对照组相比,纤维化程度有明显降低6.以30μmol/L终浓度的BrdU标记72小时,阳性标记率达80%-90%,标记细胞形态未见异常。结论:1.天然活性物质诱导单个核细胞转化为多能干细胞,干细胞特异性标志基因Nanog、Oct3/4均有阳性表达2.iMSc移植治疗后第4周,血肌酐、尿素氮水平比模型对照组低;肾小球滤过率及肾血流量有一定程度的恢复;肾脏纤维化水平降低,与肾间质纤维化相关的转化生长因子的减少3.iMSc移植后第4周,BrdU标记,追踪移植入的细胞在肾脏髓质部有分布。


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