富氢乳酸林格氏液对严重烧伤大鼠延迟复苏肺损伤的保护

【摘要】：研究背景 烧伤主要指热力、化学物质、电能、放射线等引起的皮肤、粘膜、甚至深部组织的损害。大面积烧伤作为一种严重的创伤使机体遭受沉重打击,病理生理过程极其复杂,其不仅可以导致局部烧伤部位的损伤,还可以引发远离烧伤原发部位的内脏器官损伤的全身反应,导致各系统和各器官在结构和功能方面发生一系列的紊乱。而烧伤休克后的延迟复苏是对机体的第二次打击,常造成多器官功能衰竭,其中肺是最容易受累的器官,既往资料表明大面积烧伤延迟复苏引发的急性肺损伤(ALI)被认为与烧伤的高死亡率有关。研究证实,大量的氧自由基产生和促炎因子引起的全身炎症反应在大面积烧伤延迟复苏所致ALI的发病机制中起关键作用。在ALI发生过程中内皮细胞所构成的血管内膜屏障的破坏是关键部分。最近,氢气被认为具有选择性中和部分自由基的功能,并在一些疾病模型中表现出抗炎和抗凋亡的作用。本研究的目的观察富氢乳酸林格氏液对大面积烧伤延迟复苏引起的肺损伤的影响,为烧伤的治疗寻找一种更为有效的方法。本研究分为三个部分。 第一部分富氢乳酸林格氏液在严重烧伤大鼠延迟复苏肺组织中的抗氧化及抗炎作用 目的：观察富氢乳酸林格氏液在延迟复苏严重烧伤大鼠肺组织中的抗氧化及抗炎作用。 方法：制备富氢乳酸林格氏液,采用随机数字表法将36只SD大鼠随机分为3组(每组12只)即：假烫组(S)、烫伤+普通林格氏液组(BR)和烫伤+富氢乳酸林格氏液组(BH),在普通林格氏液组和富氢乳酸林格氏液组大鼠背部造成占体表面积(TBSA)30%的Ⅲ度烫伤,普通林格氏液组和富氢乳酸林格氏液组大鼠于烫伤后7h、9h、17h,分别经腹腔补给相当于总补液体积1/2、1/4、1/4的普通林格氏液或者富氢乳酸林格氏液,假烫组不补液。处死前0.5h测大鼠血压,行动脉血气分析。24h后取肺做HE染色并双盲评分,测量肺组织的通透性,检测氧化指标MDA值和SOD活性,促炎细胞因子IL-1B和TNF-a的含量。数据统计分析。 结果：BR组血压低于S组和BH组(P0.05),BH组显著高于BR组而接近S组。血气分析显示BR组的Pa02与S组相比显著降低,而BH组与S组相比无显著差异,均高于BR组(P0.05)。病理学评分BR组评分较BH组高(P0.01)。伤后24小时在延迟复苏引起肺损伤的BR组中肺组织内伊文氏蓝的浓度明显升高,比BH组高(P0.01)。烫伤后24小时各组大鼠肺组织MDA含量和SOD的变化,BH组肺组织MDA含量低于BR组(P0.05)；BH组肺组织SOD亦介于S组和BR组之间,显著高于BR组(P0.01)。肺组织IL-1β和TNF-a的含量BH组的含量介于S组和BR组之间,高于S组,显著低于BR组(P0.01)。 结论：富氢乳酸林格氏液对大面积烧伤延迟复苏后肺损伤的保护效果主要表现为：(1)肺组织的氧化应激损伤减轻,体内酶类自由基清除剂的活力也得到一定程度的恢复；(2)肺组织促炎性细胞因子IL-1β和TNF-a的产生和释放受到遏制；(3)肺的病理学改变和肺功能得到明显缓解。这些结果表明富氢乳酸林格氏液可以部分替代和恢复组织过氧化物歧化酶作为氧自由基清除剂对肺的细胞保护作用,富氢乳酸林格氏液比传统的林格氏液更适合于用作烧伤延迟复苏的补液治疗。 第二部分富氢乳酸林格氏液减轻严重烧伤大鼠延迟复苏所致肺组织细胞的凋亡 目的：探索富氢乳酸林格氏液对烫伤大鼠的延迟复苏所致的肺组织细胞凋亡的抑制作用,以及其对几种凋亡蛋白表达的影响。 方法：取第一部分试验中的肺组织蜡块,采用TUNEL染色原位观察细胞凋亡。取第一部分试验中研磨好的肺组织粉末,采用western blotting方法观察凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化。 结果：S组未见凋亡细胞,或者仅有少数凋亡细胞。BR组和BH组凋亡细胞增多,二者凋亡细胞计数均高于S组(P0.01),在BH组凋亡细胞数少于BR组。S组分裂型Caspases-3蛋白无明显活化,BR组分裂型Caspases-3蛋白表达明显升高,而BH组分裂型Caspases-3表达高于S组,但是低于BR组,差异有统计学意义(P0.05)。促凋亡蛋白Bax表达在BR组明显高于S组和BH组(P0.01)。肺组织抗凋亡Bcl-2蛋白表达在S组和BH组明显高于BR组(P0.01)。 结论：富氢乳酸林格氏液延迟复苏烫伤大鼠可以下调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白的表达,同时可以使抗凋亡蛋白Bcl-2表达的上升。此结果印证了TUNEL检测大鼠肺组织细胞凋亡的结果。此结果说明富氢乳酸林格氏液通过影响凋亡蛋白的表达,减少凋亡的发生,从而起到保护延迟复苏烫伤大鼠肺组织的作用。 第三部分富氢培养基对烧伤血清作用的HUVEC形态及凋亡的影响 目的：利用体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模型,用烧伤血清作为致伤因子,观察富氢培养基对内皮细胞收缩和凋亡的影响,为进一步了解氢气对血管通透性的影响,并为严重烧伤的治疗模式提供一种新的思维。 方法：制备富氢培养基,6孔板培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),细胞分为正常血清对照组(C),烧伤血清+正常培养基组(B),烧伤血清+富氢培养基组(H)。细胞培养8h后使用罗丹明鬼笔环肽对细胞骨架进行染色。同样分组24h后细胞采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果：C组细胞丝状肌动蛋白在细胞中央和外周均有分布,在细胞与细胞接触处呈丝状相互连接,形成周边肌动蛋白丝带。B组内皮细胞丝状肌动蛋白重组,细胞内可见肌动蛋白丝变短,变粗,多向细胞中央集中,一些丝状肌动蛋白变得模糊。H组细胞形态大致呈圆形,胞内丝状肌动蛋白变化介于前二者之间。烧伤血清作用的B组和H组细胞凋亡率均升高。烧伤血清作用的B组细胞凋亡率显著高于C组,P0.01,差异有统计学差异。而H组细胞凋亡率低于B组,P0.01,差异有统计学差异。 结论：烧伤血清可以导致体外实验中HUVEC形态的变化和凋亡的发生,富氢培养基可以减轻在烧伤血清作用下HUVEC细胞收缩,并且减少细胞凋亡的发生。此结果为第一部分试验中富氢乳酸林格氏液延迟复苏烫伤大鼠从而降低肺组织通透性的结果提供了旁证。对于烧伤的治疗,是否可以通过干预血管内皮细胞屏障从而达到减轻渗出和减少补液量的疗效,本实验的发现为烧伤的治疗提供了新的思路和手段。