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EGFRmAb功能化修饰金纳米棒光热诱导喉鳞癌细胞凋亡分子机制研究

张世文  
【摘要】:第一部分表皮生长因子受体在喉鳞癌组织中的表达及siRNA沉默EGFR基因诱导Hep-2细胞凋亡研究 目的:检测喉鳞癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)的表达,探讨其在喉癌发生中的作用。运用RNA干扰技术研究EGFR表达下调诱导Hep-2细胞凋亡情况。 方法:收集2008年1月~2011年3月昆明医学院第一附属医院、第三附属医院头颈外科36例喉鳞癌组织标本,正常对照来自其中的13例喉全切除术标本,阳性对照选取Hep-2细胞株。运用Western Blot技术检测喉癌组织、癌旁组织及正常粘膜组织EGFR的表达,图像结果进行Quantity One软件定量分析,得出EGFR蛋白相对表达量,分析其与癌组织病理分级的关系。进而运用siRNA技术沉默Hep-2细胞EGFR基因,RT-PCR及Western Blot检测EGFR基因表达抑制效果,流式细胞术进一步检测EGFRsiRNA质粒转染48h时Hep-2细胞凋亡情况。 结果:(1)喉癌标本中EGFR蛋白的表达从高到低依次为喉鳞癌组织、癌旁组织,正常粘膜组织几乎无条带显示。喉癌组织、癌旁组织不同病理分级之间EGFR相对表达量差异有统计学意义,P0.05。相同病理分级喉癌组织、癌旁组织及正常组织之间EGFR相对表达量差异有高度统计学意义,P0.01。(2)成功获得EGFRsiRNA表达质粒pSi-hEGFR,转染Hep-2细胞48h后RT-PCR检测结果显示,EGFRmRNA表达水平下调46%,Western Blot检测获得一致的结果。pSi-hEGFR质粒转染Hep-2细胞48h后流式细胞术检测发现:EGFR阳性表达抑制率为83.8%;细胞凋亡率达(15.13±2.15)%,而pSi-Negative质粒转染组凋亡率为(7.03±1.08)%,差异有高度统计学意义,P0.01。 结论:EGFR在喉癌组织中存在过表达现象,与喉癌组织不同部位及病理分级有相关性。siRNA沉默EGFR基因可以下调Hep-2细胞EGFR mRNA和蛋白水平表达,同时发现可以诱导Hep-2细胞出现凋亡。本研究提示EGFR可能参与喉癌的发生,其表达下调可以起到部分抑瘤作用,为以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗方法的探索提供基础理论依据。 第二部分EGFRmAb功能化修饰金纳米棒光热作用抑制Hep-2细胞增殖研究 目的:用EGFRmAb功能化修饰金纳米棒(AuNRs)获得稳定的EGFRmAb/AuNRs共轭物,探索AuNRs进入Hep-2细胞的机制,了解AuNRs光热转换的升温规律,评价AuNRs的生物安全性,观察EGFRmAb功能化修饰AuNRs靶向光热效应抑制Hep-2细胞增殖作用。 方法:合成EGFRmAb/AuNRs后用透射电镜进行表征,用紫外-可见-近红外光谱仪对其进行光谱分析。将AuNRs、EGFRmAb/AuNRs分别与Hep-2细胞共孵育,透射电镜观察AuNRs进入细胞及细胞内分布。采用ICP-AES元素分析法检测EGFRmAb介导下AuNRs进入Hep-2细胞的量。NIR激光照射后用温度计测量不同状况下AuNRs溶液温度上升规律。用MTT法检测不同浓度AuNRs细胞毒性。用台盼蓝染色法大体观察AuNRs光热作用杀伤肿瘤细胞现象,继而用MTT法检测不同功率NIR激光照射AuNRs后不同时间点Hep-2细胞的增殖抑制率,比较AuNRs和EGFRmAb/AuNRs光热作用的抑瘤效果。 结果:(1)电镜表征显示本实验用AuNRs具有良好的稳定性和分散性,微粒大小均匀,长径均值为49.81nm,横径均值为12.70nm,长横比均值为3.92。紫外-可见-近红外光谱仪检测显示,AuNRs溶液表现出双共振吸收峰,横向为510nm,纵向为800nm。AuNRs经EGFRmAb修饰后纵向共振吸收峰位红移7-9nm,并不明显改变原有光学特性。(2)电镜观察显示:AuNRs和Hep-2细胞共同孵育30min时,可见AuNRs于细胞膜表面,出现胞吞现象;3h时可见AuNRs成簇状位于溶酶体内;6h时可见AuNRs同时存在于细胞质、溶酶体和线粒体内,少量AuNRs贴近核膜;未发现细胞形态和细胞器(线粒体)结构明显改变。EGFRmAb功能化修饰的AuNRs进入细胞的数量比未修饰的要多,进一步ICP-AES元素分析显示共孵育6h时EGFRmAb功能化修饰明显提高AuNRs进入细胞的数量,增加48.14%。(3)NIR激光照射AuNRs溶液可以引起温度迅速升高,温度升高的幅度和AuNRs浓度、照射功率及容器容积有一定关系。研究发现,在室温为23℃情况下,用3.0W/cm2功率NIR激光照射0.1nmol/L AuNRs溶液(1ml/每孔,24孔板)4min时温度达到46℃,随后稳定,满足本实验光热诱导凋亡的温度要求。(4)MTT法检测显示AuNRs在0.1nmol/L~2.0nmol/L浓度范围内未出现细胞活力明显下降,AuNRs/EGFRmAb共轭物对Hep-2细胞活力没有明显影响。(5)5.2W/cm2功率NIR激光照射AuNRs和Hep-2细胞共孵育培养液8min后台盼蓝染色显示细胞全部死亡。进一步MTT法检测显示:AuNRs和AuNRs/EGFRmAb光热作用可以明显引起Hep-2细胞增殖抑制,呈激光功率剂量依赖性;而单纯NIR激光照射及EGFR单抗对Hep-2细胞没有明显的增殖抑制作用;控制NIR激光功率为3.0W/cm2,则Hep-2细胞的增殖抑制呈明显的时间效应关系,72h抑制率最高,达69.24%;同时发现,AuNRs/EGFRmAb光热效应对Hep-2细胞的增殖抑制作用明显高于未修饰AuNRs, P0.01. 结论:EGFRmAb修饰AuNRs后未明显改变原有的形状和光学性质,但可以明显增加AuNRs进入Hep-2细胞的能力,推测可能和EGFR介导的胞吞有关。AuNRs进入细胞后主要存在于细胞质、溶酶体和线粒体中,其本身并没用明显的细胞毒性,但在NIR激光的照射下,能迅速引起环境温度的升高,导致细胞出现增殖抑制或死亡。控制NIR激光的照射功率,细胞的增殖抑制呈时效性。EGFRmAb功能化修饰明显提高AuNRs光热抑瘤效果,而单纯的NIR激光照射和EGFRmAb并没有明显的细胞增殖抑制现象。由于AuNRs位于细胞内线粒体中,我们推测上述细胞增殖抑制可能是AuNRs光热诱导的内源性凋亡导致的。 第三部分EGFRmAb/AuNRs光热诱导Hep-2细胞凋亡机制研究 目的:控制NIR激光照射参数,观察EGFRmAb/AuNRs光热诱导Hep-2细胞凋亡现象,通过检测线粒体途径凋亡相关蛋白分子表达来阐述凋亡分子机制,同时证明EGFRmAb功能化修饰能够有效提高AuNRs光热诱导Hep-2细胞凋亡效果。 方法:参照第二部分实验,控制NIR激光照射参数为:功率3.0W/cm2,时间8min。电镜观察照射后Hep-2细胞超微结构变化及凋亡。TUNEL/PI双染法流式细胞术检测照射后不同时间点细胞凋亡和周期,进而流式细胞术检测照射后不同时间点Hep-2细胞活化Caspase-3、Bcl-2/Bax和Cyt-c阳性表达率、细胞内ROS水平和Ca2+浓度及细胞线粒体膜电位(△甲m)下降率。 结果:(1)照射后48h电镜观察NIR+AuNRs组和NIR+EGFRmAb/AuNRs组可见细胞凋亡。(2)NIR+AuNRs组和NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞在照射后24h、48h时表现出明显的G0/G1期阻滞,同时S期比率下降,并呈时间效应关系。在照射后48h时,EGFRmAb/AuNRs组和AuNRs组相比,S期比率下降相对明显,P0.01。(3)NIR+AuNRs组与NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞在照射后出现明显凋亡,呈时间效应关系。NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞在照射后三个时间点(24h、48h、72h)的凋亡:率均比NIR+AuNRs组要高,P0.05。照射后72h时NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞凋亡率最高,达73.63%。(4)照射后NIR+AuNRs组和NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞活化Caspase-3、Bax阳性表达率、△Ψm下降率及细胞内ROS水平、Ca2+浓度升高,细胞Bcl-2阳性表达率降低。随时间推移上述指标各自变化趋势明显,但NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞上述指标改变比NIR+AuNRs组更为明显,P0.05。照射后NIR+AuNRs组与NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞Cyt-c阳性表达率明显升高。照射后1h时检出Cyt-c阳性表达,24h时最高,随后呈逐渐下降趋势。在照射后24h、48h时,NIR+EGFRmAb/AuNRs组细胞Cyt-c阳性表达率和NIR+AuNRs组比较升高更为明显,P0.01。 结论:控制合适的NIR激光照射参数可以通过AuNRs光热作用诱导Hep-2细胞出现凋亡,这种凋亡和细胞周期阻滞密切相关。ROS和Ca2+含量升高、△ψm下降、Cyt-c释放、活化Caspase-3上调及Bcl-2/Bax比例下降在上述凋亡过程中起重要作用,可以看出,线粒体介导的内源性途径是AuNRs光热诱导Hep-2细胞凋亡的重要方式。EGFRmAb功能化修饰可以通过AuNRs的靶向聚集而提高诱导凋亡的效果,但EGFR单抗本身并没有明显参与凋亡的发生。 第四部分EGFRmAb/AuNRs光热治疗裸鼠喉鳞癌移植瘤研究 目的:观察局部注射及全身静脉给药模式下AuNRs光热治疗裸鼠皮下喉癌移植瘤效果并检测治疗后肿瘤细胞凋亡情况。 方法:建立裸鼠皮下喉癌移植瘤模型。瘤体局部注射AuNRs,经尾静脉全身给EGFRmAb/AuNRs,NIR激光照射参数同第三部分体外实验,照射过程中测量肿瘤局部皮温变化,游标卡尺测量照射后肿瘤大小变化。照射后2周结束实验,绘制移植瘤生长曲线,裸鼠处死后切取肿瘤标本,TUNEL/PI双染法流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡和坏死。 结果:NIR激光照射3min后肿瘤处皮肤温度趋于稳定,AuNRs局部注射组照射后温度上升15℃,EGFRmAb/AuNRs静脉给药组照射后温度上升11℃。两观察组照射后肿瘤的生长均有明显的抑制现象,各观察时间点生长速度明显变缓,但AuNRs局部注射组照射后肿瘤抑制效果更明显一些,P0.05。单独EGFRmAb(E3138,Sigma公司)静脉给药、小剂量NIR激光照射及不经EGFRmAb修饰的AuNRs静脉给药后照射均没有产生明显的肿瘤抑制效果。流式细胞术检测发现,AuNRs局部注射组及EGFRmAb/AuNRs静脉给药组照射后2周肿瘤组织细胞出现明显的凋亡,凋亡率分别为58.35%和30.46%。AuNRs局部注射组照射后凋亡率和坏死率均明显高于EGFRmAb/AuNRs静脉给药组,P0.01。 结论:AuNRs直接瘤体注射光热作用可以明显抑制裸鼠喉癌移植瘤的生长,EGFRmAb/AuNRs静脉给药也可以起到一定的治疗效果,流式细胞术检测印证了光热诱导凋亡现象的存在。动物实验的效果给EGFRmAb/AuNRs体内靶向光热治疗肿瘤带来希望,由于体内环境的复杂性,要真正实现体内深层肿瘤安全有效的AuNRs光热治疗还需进一步深入研究。


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