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转化生长因子β1、ica操纵子对肺癌患者生物材料细菌生物膜形成的影响

雷玉洁  
【摘要】:第一部分:TGF-β1在非小细胞肺癌患者外周血及肺癌组织中的表达及与机体免疫状态的关系 [目的]:探讨非小细胞肺癌患者外周血中转化生长因子β1(TGF-β1)水平、以及肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织中TGF-β1水平与机体免疫功能的变化及其与非小细胞肺癌分期、病理类型的关系。 [方法]:2010年10月至2011年10月昆明医学院第三附属医院(云南省肿瘤医院)胸心外科住院患者,病理证实为非小细胞肺癌(NSCLC),并依据2009年国际抗癌联盟(UICC)和国际肺癌研究会(IASLC)公布的第七版肺癌国际分期法为Ⅰ-Ⅳ期患者;同期医院体检科正常健康对照人群为对照组。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测空腹外周静脉血中TGF-β1含量。免疫组化技术(IHC)二步法检测NSCLC患者肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织中TGF-β1水平,同期采用流式细胞仪检测NSCLC患者及对照组外周血中CD3+、CD4+、CD8+、 CD4+/CD8+和CD4+CD25+细胞比例,并对以上结果进行统计分析。 [结果]:NSCLC患者CD3+、CD4+、CD8+细胞比例明显低于正常对照组(P0.01);TGF-β1水平和CD4+CD25+细胞比例高于对照组(p0.01);NSCLC患者Ⅰ期和Ⅱ期CD3+、CD4+、CD8+细胞比例高于Ⅳ期和Ⅳ期(P0.01);而TGF-β1水平和CD4+CD25+细胞比例低于Ⅲ期和Ⅳ期(P0.01);但Ⅰ期和Ⅱ期之间、Ⅲ期和Ⅳ期之间无明显差异(P0.05)。在不同病理类型之间TGF-β1水平和CD3+、 CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和CD4+CD25+细胞比例无明显差异(P0.05)。IHC两步法检测NSCLC患者肺癌组织中TGF-β1蛋白阳性表达率高于癌旁组织及正常肺组织(P0.01),但癌旁组织及周边正常肺组织中TGF-β1蛋白阳性表达率无明显差异(P0.05)。 [结论]:NSCLC患者外周血中TGF-β1和CD4+CD25+水平与患者的免疫功能呈负相关:肺癌患者TNM分期越晚,机体细胞免疫功能越低,TGF-β1水平越高、CD4+CD25+细胞比例越高;但TGF-β1水平在NSCLC不同病理类型间无差异,肺癌组织中TGF-β1蛋白阳性表达率高于癌旁组织及正常肺组织,NSCLC患者癌旁组织及周边正常肺组织TGF-β1蛋白阳性表达率无显著性差异。 第二部分肺癌患者中心静脉导管相关表皮葡萄球菌ica、PIA因子、TGF-β1基因对细菌生物膜形成的影响 [目的]分析肺癌患者中心静脉导管相关表皮葡萄球菌icaA、icaD、icaR mRNA表达及PIA因子在不同水平的转化生长因子β1(TGF-β1)作用下,对细菌生物膜形成的影响。 [方法]1.分离肺癌患者体内中心静脉导管表面粘附的表皮葡萄球菌临床分离株,种属鉴定中心静脉导管相关性血流感染者为表皮葡萄球菌类型后,行细菌基因组DNA抽提,PCR法检测生物膜形成相关基因icaA、icaD、icaR DNA表达,刚果红琼脂培养法检测PIA因子。分析icaA、icaD、icaR操纵子的携带情况PIA因子表达之间的关系;并建立稳定的PIA表型阴性、阳性的表葡菌临床分离株。2.体外培养云南宣威肺腺癌XWLC-05细胞株,稳定传代后,加入不同浓度组(0、5、10、20ng/ml)TGF-β1与NSCLC患者外周静脉血中分离出单个核细胞(PBMCs)共培养的上清液继续培养,24小时后,流式细胞仪(FCM)检测各组免疫相关因子CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和CD4+CD25+细胞数量及上清液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ因子水平。3.将以上培养72小时的TGF-β1四个不同浓度组的XWLC-05细胞株上清液加入表皮葡萄球菌生物膜阴性、阳性标准株及临床分离的PIA+、PIA-的表皮葡萄球菌共同培养,并加入医用聚氨酯为生物材料,建立各组表皮葡萄球菌生物膜(BF)模型。4.在共培养72小时后取出生物膜,用半定量生物膜形成实验检测各组聚氨酯表面生物膜形成情况,用激光共聚焦显微镜连续观察各组生物膜生长情况及厚度;扫描电镜观察生物膜表面状态。 [结果]1.分离出68例表皮葡萄球菌临床分离株,提取DNA经过PCR产物凝胶电泳检验,icaA基因阳性菌株31株,阳性率为45.6%(31/68),icaD基因阳性菌株31株,阳性率为45.6%(31/68),icaA.icaD基因阳性株中25例PIA阳性,占80.6%(25/31);icaA.icaD基因阴性株中仅有3例PIA阳性,占8.1%(3/37)。两者比较,icaA.icaD基因DNA表达阳性临床株与PIA阳性表达呈正相关(χ2=25.37,p0.01)。2.PBMCs介导下,24小时后,5、10、20ng/ml TGF-β1组XWLC-05细胞株培养液中CD3+.CD4+.CD8+细胞比例低于0ng/ml TGF-β1组(P0.01);呈剂量效应负相关关系。CD4+/CD8+和CD4+CD25+细胞比例高于未加TGF-β1组(P0.01);呈剂量效应正相关关系。5.10.20ng/ml TGF-β1组XWLC-05细胞株上清液中IL-2、TNF.IFN-γ因子水平低于未加TGF-β1组(P0.01);呈剂量效应负相关关系。IL-6水平高于未加TGF-β1组(P0.01);呈剂量效应正相关关系。IL-4、IL-10因子水平较未加TGF-β1组无变化(P0.05)。3.加入不同浓度TGF-β1上清液的表皮葡萄球菌生物膜阳性标准株及PIA+临床株与医用聚氨酯共培养72小时,10.20ng/ml TGF-β1组生物膜厚度高于0ng/ml TGF-β1组(F=26.57,P0.01);5ng/ml TGF-β1组与0ng/ml TGF-β1组生物膜厚度无差异(F=1.574,P0.05)。进一步组间比较q检验提示10ng/ml与20ng/ml TGF-β1组生物膜厚度无差异(P0.05)。4.加入不同浓度TGF-β1上清液的表皮葡萄球菌生物膜阴性标准株及PIA—临床株与医用聚氨酯共培养72小时:5ng、10ng.20ng/ml TGF-β1组生物膜厚度与0ng/ml TGF-β1组生物膜厚度无差异(F=3.157,P0.05);进一步组间比较q检验提示0ng、5ng、10ng、20ng/ml TGF-β1组生物膜厚度无差异(P0.05)。 [结论]1.表皮葡萄球菌相关性血流感染肺癌患者表皮葡萄球菌操纵子icaA. icaD基因表达与PIA的合成密切相关,在操纵PIA因子合成中起一定作用。2.PBMCs介导下,TGF-β1对肺腺癌细胞株CD3+、CD4+、CD8+细胞因子有抑制作用;对肺腺癌细胞株CD4+/CD8+和CD4+CD25+细胞因子有促进作用。TGF-β1能降低肺腺癌细胞的细胞因子释放,抑制细胞免疫。3.、PBMCs介导下,TGF-β1对肺腺癌细胞株Thl因子:IL-2、TNF.IFN-γ有抑制作用;对Th2因子:IL-6水平有促进作用,但对IL-4、IL-10因子水平无明显影响。TGF-β1引起了肺腺癌细胞株Th1/Th2细胞因子的平衡失调,造成Th1/Th2漂移,易引起Th1细胞主导机体的细胞免疫功能下降。4.高浓度TGF-β1因子对表皮葡萄球菌生物膜阳性标准株及PIA+临床株在生物材料表面生物膜形成有一定促进作用;TGF-β1因子对表皮葡萄球菌生物膜阴性标准株及PIA—临床株在生物材料表面生物膜的形成无影响。 第三部分:TGF-β1对树鼬体内生物材料为中心感染(BCI)模型表皮葡萄球菌生物膜形成的影响 [目的]了解TGF-β1因子对树鼬辅助性T细胞亚群:Th1/Th2细胞因子水平的关系,探讨不同水平TGF-β1因子对树鼬以中心静脉导管为中心表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。 [方法] 1.根据树鼩体重经尾静脉内注入各浓度的TGF-β1因子(100ng/kg、200ng/kg、400ng/kg),48小时后抽取1ml静脉血用流式细胞仪测各组Thl细胞因子:IL-2、TNF、IFN-γ及Th2细胞因子:IL-6、IL-4、IL-10水平。 2.在树鼩在股静脉处行中心静脉插管(医用聚氨酯)建立树鼬生物材料模型,经静脉插管内注射浓度不同的TGF-β1因子(100ng/kg、200ng/kg、400ng/kg)并设对照组,再通过股静脉插管分别注入PIA表型阴性、阳性的表葡菌标准株和临床分离株,形成树鼩以生物材料为中心的细菌感染(BCI)模型。 3.插管后72小时取出股静脉内中心静脉导管,分为3份,观测不同水平TGF-β1因子树鼬BCI模型实验组及对照组动物中心静脉导管BCI模型:(1)API细菌鉴定系统进行细菌鉴定(2)用半定量生物膜形成实验检测各组细菌生物膜形成情况;(3)扫描电镜观察生物膜形成情况。 [结果] 1.静脉内注射三个浓度的TGF-β1(100ng/kg、200ng/kg、400ng/kg)组树鼩Thl细胞因子:IL-2、TNF、IFN-γ低于正常组(F=18.124,P0.05);进一步组间两两q检验提示:100ng、200ng组间无明显差异(P0.05),400ng组低于100ng、200ng组(P0.01)。Th2细胞因子:IL-6、IL-4、IL-10均高于正常组(F=15.421,P0.05)。进一步组间两两q检验提示:200ng组间无明显差异(P0.05),400ng组高于100ng、200ng组(P0.01)。 2.建立树鼩表葡菌PIA阳性BCI模型:采用表葡菌PIA阳性标准株(ATCC35984),72小时后,取出股静脉内中心静脉导管,用半定量生物膜形成实验提示:三个浓度的TGF-β1(100ng/kg、200ng/kg、400ng/kg)组树鼩生物膜形成阳性率均高于未注入TGF-β1组(Hc=59.68,P0.01);进一步两两比较提示:100ng、200ng、400ng TGF-β1组之间生物膜阳性率无显著差异(t=3.26,P0.05)。树鼩中心静脉导管内生物膜扫描电镜观察提示:200ng、400ng TGF-β1组表葡菌间生物膜形成能力高于100ng TGF-β1组和对照组。 3.树鼩表葡菌PIA阴性BCI模型:采用表葡菌PIA阴性标准株(ATCC12228),72小时后,取出股静脉内中心静脉导管,用半定量生物膜形成实验提示:三个浓度的TGF-β1(100ng/kg、200ng/kg、400ng/kg)组树鼩生物膜形成阳性率与未注入TGF-β1组相比无显著差异(Hc=2.741,P0.05);进一步两两比较提示:100ng、200ng、400ng TGF-β1组之间生物膜阳性率无显著差异(t=3.26,P0.05)。树鼩中心静脉导管内生物膜扫描电镜观察提示:100ng、200ng、400ng TGF-β1组表葡菌间生物膜形态与对照组无明显差异。 [结论] 1.树鼩体内TGF-β1浓度增高对辅助性T细胞亚群Thl因子有抑制作用,对Th2因子中IL-6水平有促进作用,且与TGF-β1浓度有一定正相关关系;TGF-β1引起了树鼩体内Th1/Th2细胞因子的平衡失调,造成Th1/Th2漂移,易引起Thl细胞主导的细胞免疫功能下降。 2TGF-β1因子对树鼩表皮葡萄球菌PIA+菌株BCI模型生物膜形成有促进作用;TGF-β1因子对树鼩表皮葡萄球菌PIA—菌株在体内中心静脉导管表面生物膜的形成无明显影响。


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