收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

携带凋亡素基因的重组腺相关病毒抑制膀胱癌作用的研究

王春晖  
【摘要】:研究目的 1.制备携带凋亡素基因的重组腺相关病毒rAAV-VP3,并鉴定其在体外能否发挥生物学活性。 2.探讨制备与纯化凋亡素蛋白多克隆抗体的方法,并对纯化后抗体的有效性和特异性进行免疫学评价。 3.探讨并分析重组腺相关病毒rAAV-VP3对人膀胱癌细胞的感染特点、体外抑制膀胱癌效应及其可能的作用机理。 4.评价携带凋亡素基因的重组腺相关病毒rAAV-VP3对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗作用与效果,并对其作用机理进行探讨。 研究方法 1.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析:将VP3基因通过基因重组的方法克隆至pAAV-MCS载体中,经EcoRI/Sal Ⅰ双酶切鉴定和基因测序无误后将其与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-VP3。收获病毒后采用氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠沉淀-氯仿抽提3个步骤进行病毒的分离、浓缩和纯化;PCR扩增病毒液中的目的基因鉴定重组病毒的包装是否成功。病毒液负染后透射电镜观察病毒颗粒,并用地高辛标记的CMV探针点杂交方法检测病毒液中rAAV-VP3的物理滴度;利用RT-PCR检测感染重组病毒后VP3基因在Vero细胞中的转录,免疫荧光检测VP3蛋白在Vero细胞中的表达。 2.VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价:用真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经Nde I/BamH I双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染EJ、T24以及Vero细胞72h后行免疫荧光.Western blot检测,对抗体的特异性进行免疫学评价。 3.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用:利用MTT法检测凋亡素重组腺相关病毒对T24、EJ细胞的MOI值及其对膀胱癌细胞增殖的影响;RT-PCR检测凋亡素在T24、EJ细胞中的转录,Western Blot检测凋亡素蛋白在膀胱癌细胞中的表达;透射电镜、DNA Ladder法观察和判定膀胱癌细胞凋亡;流式细胞术PI法检测重组病毒对膀胱癌细胞周期的影响,Annexin V-FITC/PI双染法检测感染重组病毒后T24、EJ细胞的凋亡;Western Blot检测凋亡素对膀胱癌细胞中的Survivin表达的影响;Elisa检测凋亡素对膀胱癌细胞凋亡通路中caspase-3的激活作用。 4.凋亡素重组腺相关病毒对荷人膀胱癌Balb/c裸鼠的基因治疗评价:建立荷人膀胱癌Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,将动物随机分为未治疗组、对照病毒rAAV-EGFP组、丝裂霉素C(MMC)治疗组、rAAV-VP3治疗组共4组,病毒组注射剂量为1×1010v.g./50μl/只,MMC用量1mg/kg,均采用瘤周及瘤内多点注射法。通过绘制皮下移植瘤生长曲线、计算平均瘤重和抑制率、大体观察和病理组织学检查观察凋亡素重组腺相关病毒对Balb/c裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,通过观察各组裸鼠治疗过程中一般情况、各组裸鼠存活率的比较评价治疗效果。免疫组化染色观察注射重组病毒后VP3蛋白在瘤内的表达时效性,免疫组化法计数阳性细胞所占百分比观察rAAV-VP3治疗组与对照病毒rAAV-EGFP组Ki.67、C-erbB-2、Rb、nm23的表达差异。实验结果 1.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒的包装、纯化、鉴定及体外生物学活性分析:重组质粒pAAV-VP3经酶切鉴定和基因测序正确,三质粒共转染AAV-293细胞72小时后重组腺相关病毒rAAV-VP3包装成功,收获的重组病毒纯化后滴度为5.1×1011v.g./ml,电镜下可见病毒颗粒。感染Vero细胞后,可检测到VP3基因的转录和蛋白表达。 2.VP3蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价:原核表达载体pET8a-VP3的构建成功并经PCR鉴定和基因测序正确;原核表达菌株pET8a-VP3/BL21经终浓度为0.4mM的IPTG诱导4小时后在14.4kDa与20kDa之间出现目的条带,其大小与预期结果相符合,外源蛋白成功表达;收集洗脱峰,SDS-PAGE检测VP3蛋白纯度良好,无明显杂带。用纯化后的VP3蛋白免疫新西兰大耳白兔后抗血清效价可达1:243000,采用Protein A纯化总IgG, SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体纯度较高,无明显杂带,间接ELISA法检测抗体灵敏度为5.4ng/ml;将rAAV-VP3感染EJ、T24以及Vero细胞72小时后行免疫荧光检测,可见特异性内源性表达的VP3蛋白以及核定位效应。在EJ和T24细胞中凋亡素主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质,行Western blot检测,于接近14kDa处可见特异性的目的条带。 3.携带凋亡素基因的重组腺相关病毒对膀胱癌的体外抑制作用:MTT法显示以MOI值2.0×104v.g./cell、1.0×105v.g./cell、2.0×105v.g./cell、5.0×105v.g./cell、1.0×106v.g./cell分别感染T24细胞和EJ细胞后72h, MOI=5.0×105v.g./cell时rAAV-VP3对T24细胞和EJ细胞的杀伤效应最为明显,增加感染复数不能进一步增强rAAV-VP3对膀胱癌细胞的杀伤效应;感染重组腺相关病毒rAAV-VP3的T24、EJ细胞增殖活性均明显下降,且随时间的推移效果更明显,而细胞对照组和rAAV-eGFP的OD490值都逐渐小幅上升,60h以后则逐渐下降(P0.01)。透射电镜观察膀胱癌细胞出现核固缩、凋亡小体等典型的凋亡形态学改变,DNA Ladder法显示在100bp左右形成断裂的DNA片段;通过RT-PCR和Western Blot可检测到重组腺相关病毒rAAV-VP3感染膀胱癌细胞后能在T24、EJ细胞中转录与表达;流式细胞术PI法检测发现重组腺相关病毒rAAV-VP3感染膀胱癌细胞后与对照组比较S期细胞比例降低和G2M期细胞比例增多(P0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法检测到感染rAAV-VP3后T24、EJ细胞发生凋亡的比例明显升高。Western Blot检测腺相关病毒介导的凋亡素蛋白表达可抑制内源性Survivin的表达,而对照病毒rAAV-LacZ作用的T24、EJ细胞内源性Survivin为高表达状态。Elisa法检测感染第3d、4d、5d后T24和EJ细胞中激活型caspase-3的含量明显增高,与对照病毒组和细胞对照组比较差异有统计学意义(P0.01)。 4.重组腺相关病毒rAAV-VP3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,有较高的肿瘤抑制率并能提高裸鼠的存活率,生存中位数时间为55天,瘤内注射重组腺相关病毒rAAV-VP3后,可以观察到VP3蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,于21天左右达到顶峰,以后一直维持强阳性表达;免疫组化检测发现重组腺相关病毒rAAV-VP3可抑制Ki-67、C-erbB-2的表达,并能上调肿瘤转移抑制基因Rb、nm23的表达。结论 1.包装的重组腺相关病毒rAAV-VP3在体外能够发挥生物学活性。 2.制备的凋亡素蛋白多克隆抗体具有较强的灵敏度和特异性,证实了凋亡素在正常细胞中定位于细胞质,而在肿瘤细胞中则定位于细胞核。 3.重组腺相关病毒rAAV-VP3对T24、EJ细胞的最适感染复数为5.0×105v.g./cell,感染rAAV-VP3后膀胱癌细胞的增殖受到抑制,主要作用于肿瘤细胞的S期和G2/M期,发生G2/M期阻滞,引起细胞DNA合成受阻和降解。腺相关病毒介导的凋亡素蛋白表达可抑制内源性Survivin的表达,提示VP3与Survivin的存在拮抗性,可能是凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制之一;caspase-3的激活是凋亡素诱导的细胞凋亡通路中的关键分子信号之一 4.重组腺相关病毒rAAV-VP3能明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长,并能减少肿瘤对周围组织的侵犯与瘤栓形成。基因治疗后能提高裸鼠的存活率,与MMC治疗组相比具有一定的优越性。其介导的VP3蛋白表达量呈逐渐升高的趋势,凋亡素体内抑制膀胱癌的作用机制可能与其抑制Ki-67、C-erbB-2的表达,并上调肿瘤转移抑制基因Rb、nm23的表达有关。 5.利用腺相关病毒介导凋亡素基因的表达治疗膀胱癌的策略可行,为下一步运用该重组腺相关病毒进行临床前研究奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 马巍,刘淼,杨广笑,王全颖;重组腺相关病毒转导NIH3T3建立神经生长因子真核表达细胞株的研究[J];中国脊柱脊髓杂志;2004年09期
2 张宜乾;张中明;闫英群;董红燕;;氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF_(165)基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定[J];徐州医学院学报;2007年02期
3 林敬阳;秦瑾;刘正湘;刘毓;程忠良;左后娟;汪道文;;突变型pAAV-CD151真核表达载体的构建与鉴定[J];华中科技大学学报(医学版);2009年06期
4 白育庭;闵清;查文良;高卉;万敬枝;;重组VEGF_(165)基因腺相关病毒的包装和鉴定[J];医药论坛杂志;2010年14期
5 王建明;范雅稚;惠娜;熊蕾;冯海晓;孙乃学;;重组腺相关病毒作为目标基因转移视网膜的载体的可行性研究(英文)[J];国际眼科杂志;2008年09期
6 张宁坤;陈宇;高连如;费宇行;刘英明;许如意;李贤峰;王志国;王浩;王兆君;曹毅;王丽华;李俊风;李莉;刘丽娟;杨晔;;腺相关病毒2/1型载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究[J];中国实验血液学杂志;2009年03期
7 周炼红,胡燕华,徐惠明,汪道文;炎症增强报告基因在角膜内皮的表达[J];华中科技大学学报(医学版);2005年03期
8 王家宁;汪璐云;汪培华;杨仕林;汪道文;;重组腺相关病毒介导的细胞色素P450表氧化酶基因对TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响[J];中国分子心脏病学杂志;2006年02期
9 梁春敏;钟翠平;郑宁;刘彬彬;孙瑞霞;吴欣;刘银坤;叶胜龙;;SLC基因修饰树突状细胞及不同免疫方式抗肿瘤作用探讨[J];中国免疫学杂志;2006年08期
10 蒋星;杨昌永;毛棉;刘强强;王莉;;两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究[J];四川大学学报(医学版);2010年02期
11 陈敏;项红兵;田玉科;;携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0的构建[J];肿瘤学杂志;2011年01期
12 黎红华,张苏明,方思羽,王燕,汪道文,XiaoXiao;重组腺相关病毒介导的Dystrophin小基因载体构建及在mdx鼠中表达[J];中国临床神经科学;2003年03期
13 高峰;田玉科;杨辉;安珂;张传汉;;增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达[J];第四军医大学学报;2006年03期
14 邢俊平;孙建华;崔险峰;邱曙东;;可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒体外转染培养的血管内皮细胞及其表达[J];中国男科学杂志;2006年01期
15 刘雄;李刚;李琦;田文栋;张威;陈怀宏;李湘平;;重组腺相关病毒协同重组腺病毒增强目的基因表达的体内试验[J];南方医科大学学报;2011年01期
16 时小燕,吴勇杰,高凯,王军志;人神经生长因子基因血管内给药的安全性评价[J];中国临床药理学与治疗学;2003年01期
17 黄畦;刘正湘;蓝荣芳;宋玉娥;刘晓春;张欣;汪道文;;rAAV-CD151基因在大鼠缺血后肢血管再生中的作用及血管造影评分[J];放射学实践;2005年12期
18 汤明芳;于健;白浪;刘琼;;8型重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因在角膜基质细胞中的表达及影响[J];国际眼科杂志;2011年05期
19 陆华中,陈立,王红卫,卢大儒,邱信芳,薛京伦,伍志坚,吴小兵,王学峰,王鸿利;重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用[J];中国科学C辑;2001年06期
20 杨宇,王全师,吴江,胡海涛,胡林森,杨广笑;通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究[J];中风与神经疾病杂志;2004年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王萍;阎钟钰;丛敏;唐淑珍;王宝恩;贾继东;刘勇;尤红;;重组腺相关病毒高效感染体外培养的肝卵圆细胞[A];中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议论文汇编[C];2005年
2 宋柳江;栗炳南;刘珍清;张娟;李志艳;谭孟群;;Rep蛋白表达水平与重组腺相关病毒转染效率关系的研究[A];湖南省首届生理—药理科学青年论坛论文摘要汇编[C];2009年
3 柯金;龙星;郑立武;张念光;;重组腺相关病毒2介导的人骨形态发生蛋白-2基因转染对兔骨髓间充质干细胞成骨能力的影响[A];第八届全国颞下颌关节病学及(牙合)学大会论文汇编[C];2011年
4 周炼红;朱祥祥;陈希;邢怡桥;巩丽清;;重组腺相关病毒介导的血管内皮生长因子反义核苷酸对糖尿病视网膜病变的影响[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年
5 王萍;阎钟钰;丛敏;唐淑珍;王宝恩;贾继东;尤红;;重组腺相关病毒高效感染体外培养的肝卵圆细胞[A];第十三次全国中西医结合肝病学术会议论文汇编[C];2004年
6 王慧;夏力;殷善开;;重组腺相关病毒携带EGFP基因经圆窗膜途径转导豚鼠耳蜗[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
7 陈焱;陈方平;彭建强;吴小兵;吴新华;傅敢;;2型重组腺相关病毒对脐血CD_(34)~+造血干细胞的转导效率研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
8 魏佳军;张旻;卜碧涛;张苏明;徐金枝;王雪贞;降风;郝又国;李丽娟;;携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒对C型尼曼-皮克病小鼠行为学的影响[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
9 马泳泳;杜建伟;解勤之;王光平;吴小兵;彭建强;陈方平;;重组腺相关病毒/人凝血因子IX基因在人/鼠结肠上皮细胞中表达的研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年
10 高凯;林建伟;饶春明;王军志;;重组腺相关病毒(rAAV)基因转移系统进展及其质量研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王春晖;携带凋亡素基因的重组腺相关病毒抑制膀胱癌作用的研究[D];昆明医科大学;2012年
2 王明宇;可分泌Aβ阻断肽的重组腺相关病毒的神经保护作用研究[D];吉林大学;2012年
3 胡贵方;表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
4 于金录;重组表达NT4-CGRP腺相关病毒的构建及对鸡胚血管痉挛的治疗作用研究[D];吉林大学;2011年
5 陈立;重组腺相关病毒载体介导的血友病B小鼠基因治疗[D];复旦大学;2003年
6 杨卿;重组腺相关病毒介导NF-κB/p65 shRNA改善mdx小鼠肌肉病变的作用研究[D];华中科技大学;2012年
7 魏佳军;携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒对C型Niemann-Pick病小鼠的神经保护作用[D];华中科技大学;2008年
8 窦万臣;神经干细胞基因转染及局灶性脑缺血神经干细胞移植的实验研究[D];中国协和医科大学;2004年
9 杨广;利用RNA干扰技术抑制受磷蛋白基因表达治疗慢性心力衰竭大鼠的研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
10 潘建青;重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的试验研究[D];华中科技大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 袁小洪;重组腺相关病毒介导TGF-β_1基因修饰脂肪干细胞成软骨细胞的研究[D];遵义医学院;2010年
2 马衣努尔﹒买提托合提;重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的治疗作用研究[D];华中科技大学;2010年
3 王立峰;重组腺相关病毒载体介导的人LCAT和/或apoA-I在肌源性细胞中的表达[D];南京医科大学;2001年
4 王雪燕;重组腺相关病毒体外诱导人树突状细胞的研究[D];重庆医科大学;2003年
5 杨静;rAAV2介导EGFP基因体内转染兔晶状体上皮细胞的研究[D];中南大学;2009年
6 梁政;rAAV/AFP转染对人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能研究[D];第一军医大学;2005年
7 周立辉;干扰素α-1b抑制肝异位鼻咽癌种植瘤生长和转移的实验研究[D];南方医科大学;2007年
8 谢文跃;超声微泡造影剂促进重组腺相关病毒载体介导基因转染视网膜神经节细胞的体内实验[D];重庆医科大学;2010年
9 朱成英;重组腺相关病毒携带CEA感染DC诱导CTL抗lovo直肠癌细胞活性的研究[D];山西医科大学;2012年
10 刘菁;携带人护骨素的重组腺相关病毒感染滑膜细胞的体外研究[D];第二军医大学;2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 蔡敏黎昌政;用“病毒搭载因子”打开“脑栓塞”[N];科技日报;2002年
2 吴一福;eGFP基因可用于神经前体细胞体内移植[N];中国医药报;2006年
3 李丽芸;膀胱癌易复发 术后要定期检查[N];卫生与生活报;2010年
4 记者雷志勇;基因疗法治高血压动物实验获得成功[N];健康报;2002年
5 雷志勇;高血压基因治疗动物实验获重大突破[N];光明日报;2002年
6 张中桥;鸦胆子油乳灌注最理想[N];大众卫生报;2004年
7 北京大学泌尿外科研究所教授 俞莉章 北京大学免疫系教授 谢蜀生;生物导弹治疗膀胱癌[N];健康报;2000年
8 高国起;膀胱癌基因治疗方法创新[N];健康报;2003年
9 钟伟;膀胱癌是如何播种的[N];健康报;2004年
10 高国起;膀胱癌基因治疗新技术[N];科技日报;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978