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乳腺癌回流淋巴结靶向微泡的制备研究

杨阳  
【摘要】:目的:①优化制备抗体高粘附率淋巴管靶向脂质微泡,即载VEGFR-3抗体和Podoplanin抗体的靶向微泡并做相关理化性质评价。②在体外试验中观察其寻靶效果。③探讨体外试验中,推动超声造影剂位移的有效超声辐射力参数。方法:①利用生物素-亲和素桥接法制备载VEGFR-3抗体和Podoplanin抗体的靶向脂质微泡,优化制备工艺、改进制作流程、调整脂质、生物素及亲和素配比,利用免疫荧光进行相关评价②采用分组对照试验,以直接、间接法观察寻靶效果,直接法:普通微泡与靶向微泡分别加入到淋巴管细胞培养皿中,孵育10min,洗涤3遍,将两组置于显微镜下进行观察,使用图像分析软件IPP进行离线分析及采用SPSS软件包对与细胞结合的微泡数量进行统计学分析;间接法:利用微泡和细胞重量的差异,采用分组孵育、离心法直观观察靶向结合效果③分别在流体静止及模拟淋巴液流动条件下,以及管腔处于深部时,寻找推动微泡位移到对侧管壁的最佳辐射力参数,利用高速摄像机评价其对微泡的推移效果。结果:①成功制备了高粘附率靶向微泡:平均粒径为0.99μm,流式细胞仪证实平均抗体结合率达81.3%②图像软件IPP离线分析显示靶向组微泡与淋巴管内皮细胞结合数量明显优于普通组;高倍显微镜下(×100倍)靶向组平均每个视野有(151±20)个靶向微泡粘附,普通组平均每个视野有(12±4)个普通微泡粘附(t=19.19,P0.01,结果有显著统计学差异);与普通微泡相比,靶向微泡与细胞大量结合,且在400g离心力下仍能保持牢固的链接③静止条件下,峰值负压530kPa,占空比0.031,脉冲重复频率0.97kHz,声强0.29w/cm2,机械指数0.35,恰好能使微泡贴于对侧管壁;以淋巴液流速流动时,有1/2左右的微泡从管腔中央流走,而没贴于管壁,若加大辐照参数,虽贴壁微泡增多,但75%被高声压击破;辐射力先作用于浅部管腔,浅部管腔中的微泡被完全阻断或分离开后深部管腔内微泡才能受到声辐射力作用。结论:①在生物素-亲和素桥接法的基础上,对靶向微泡的制备工艺、流程、试剂配比等方面进行相关优化,成功制备了粒径小而均一的VEGFR-3抗体及Podoplanin抗体高粘附率淋巴管靶向微泡,并在体外寻靶试验中得到验证;②此抗体高粘附率靶向造影剂的成功制备及较好的体外寻靶效果,为在体肿瘤新生淋巴管靶向显影提供了重要实验基础,有望使造影剂大量聚集、长时间停留在肿瘤新生淋巴管靶区,增强对比显像效果,相比快速消退的非靶区更容易被识别。也就是说,这种抗体高粘附率靶向微泡有望作为一种特异性识别淋巴系统肿瘤细胞的分子探针,在超声追踪下,准确显示肿瘤新生淋巴管,并对肿瘤良恶性质做出快速鉴别;③辐射力可推移管腔中的微泡更多的贴壁,但在不同流动状态下及位置条件下所需辐射力参数和效果不同。


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