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碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌检测及其临床感染特征和危险因素分析

刘淑敏  
【摘要】:[目的]筛选昆明医科大学第一附属医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE),分析CRE菌株的耐药表型、分子流行特点及克隆株播散情况;了解碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的菌种、标本类型、科室分布等临床感染特征和CRE感染的临床危险因素,为临床合理用药、及时有效抗感染提供指导。[方法]①收集2011年12月-2014年12月临床送检的标本,通过VITEK-2系统进行菌种鉴定和药敏试验,初步筛选出碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌,然后采用CLSI推荐的改良Hodge试验进行碳青霉烯酶表型确证试验,同时对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌进行金属酶(MBL)和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药表型确证试验,初步了解CRE菌株的产酶情况;②通过聚合酶链式反应(PCR)特异性扩增碳青霉烯类(KPC-2、SME、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48)和ESBLs类(SHV、 TEM、CTX-M)耐药基因,并对PCR扩增阳性产物测序,明确患者所携带的耐药基因型别,探讨本院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的分子流行特点;③采用肠杆菌科基因间重复序列PCR((ERIC-PCR)的方法,对分离菌株基因组DNA分子进行扩增,扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中120V电泳35min,电泳结束后在紫外凝胶成像仪下拍照,扩增条带位置完全相同则为同一基因型,主条带位置相同,副带相差1-2条者为亚型,不符合上述条件者为不同基因型,分析CRE菌株间的克隆播散情况;④详细分析CRE感染者所携带的病原菌,包括CRE菌株中不同菌种的流行率、菌株来源及其科室分布,结合其耐药基因检出情况,探讨本院CRE菌株在各临床科室和不同感染性疾病中的流行状况,揭示其临床感染特征;⑤回顾性分析患者的病例资料,以CRE感染或携带者为实验组,同期临床分离出感染或携带碳青霉烯类抗生素敏感的肠杆菌科细菌(CSE)的患者为对照组,采用格式化表格分别查阅CRE和CSE患者的临床信息,主要包括性别、年龄、基础疾病、抗生素使用情况、侵入性操作、住院时长、激素使用情况、总费用和预后等,对两组资料分别进行单因素和多因素分析,研究临床工作中可能诱发CRE感染或携带的临床危险因素。[结果]①药敏结果显示CRE菌株对头孢菌素及其含酶抑制剂的耐药率90%、喹诺酮类耐药率达80%、阿米卡星耐药率为60.6%、甚至对强抗菌活性的碳青酶烯类抗生素耐药率均75%,显著呈现出多重耐药的特点,而四环素由于临床使用较少,耐药率相对较低(31.4%);②耐药表型与耐药基因相关性分析显示改良Hodge试验(MHT)阳性率高达87.4%,国内外研究表明其对A类碳青霉烯酶KPC-2的敏感性较高,但PCR结果显示耐药基因KPC-2阳性率仅为61.6%;另外,金属酶表型阳性率为33%,相应B类碳青霉烯酶(金属酶)耐药基因阳性率为IMP-4 (50.5%)、NDM-1(19.4%), ESBLs表型阳性率42.7%,其耐药基因阳性率分别为TEM-1(85.4%)、SHV-12(71.3%)和CTX-M-15(21%);可见,传统的耐药表型确证试验与PCR特异性扩增结果存在一定差异,这可能是由于CRE菌株多为复合产酶菌株,耐药机制复杂,并且不同表型确证试验的灵敏度和特异度有所差异,因此,耐药表型确证试验并不能准确反应碳青霉烯类耐药菌株耐药基因的携带情况,但在不适合开展PCR的医疗机构,可作为碳青霉烯类耐药菌株的筛选试验;③ERIC-PCR分析表明CRE菌株存在2个主要的克隆型别:125株肺炎克雷伯菌和10株弗氏枸橼酸杆菌为相同克隆型,另有31株CRE为其克隆亚型,说明以肺炎克雷伯菌为代表的CRE克隆株已经开始播散于肠杆菌科不同菌属中,并且这些CRE克隆株分离自多个临床科室,如急诊重症监护室、重症监护室和移植中心等,表明克隆播散的范围逐渐扩大,耐药形势愈加严峻;另外6株阴沟肠杆菌和2株大肠埃希菌为同一克隆型,新的克隆株的出现再次加剧了CRE的流行,增加了耐药控制的难度;④临床感染特征分析显示共收集到CRE菌株206株,菌种分布以肺炎克雷伯菌多见(71%),其次为弗氏柠檬酸杆菌(10%)、大肠埃希菌(9.7%)、阴沟肠杆菌(4.4%)、其它(4.9%),科室分布主要集中在EICU(33.5%)、ICU(13.6%)和移植中心(18%),标本类型以呼吸道痰液(44.7%)和尿液标本(33%)为主;⑤回顾性分析CRE感染者的病史资料,并以感染或携带碳青霉烯类敏感的肠杆菌科细菌(CSE)的患者为对照组,单因素分析表明抗生素使用(β-内酰胺酶抑制剂、美罗培南、万古霉素、亚胺培南西司他丁钠、替加环素)、机械通气、高血压、多器官功能衰竭(MODS)、激素使用、住院时长、总费用和患者性别是CRE感染的危险因素;采用二分类非条件Logist回归进行多因素分析,使CRE组和CSE组除对碳青霉烯类药物的敏感性不同外,其它条件基本一致,表明美罗培南、高血压、多器官功能衰竭、性别和总费用分别是CRE感染的独立危险因素。[结论]①CRE菌株对临床常用抗菌药物高度耐药,甚至对碳青霉烯类抗生素耐药率均75%,显著呈现出多重耐药的特点;②耐药表型结合PCR特异性扩增显示CRE菌株耐药机制复杂,多为复合产酶菌株,常同时携带多种耐药基因型;③ERIC-PCR分析显示碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌在不同菌属和多个临床科室间均有相同克隆株流行,表明CRE菌株在本院出现了小范围的克隆播散;④临床感染特征分析显示2011年-2014年本院CRE菌株快速增长(0.8%-7.7%),临床分离的CRE菌株以肺炎克雷伯菌为主(71%),主要分离自呼吸道痰液(44.7%)和尿液标本(33%),科室分布集中在急诊重症监护病房、重症监护病房和移植中心;⑤回顾性分析患者病史资料表明美罗培南、高血压、多器官功能衰竭、性别和总费用分别是CRE感染的独立危险因素;


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