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肝素结合纤维蛋白负载PRP对股骨头缺血坏死治疗的研究

张俊  
【摘要】:[背景]股骨头缺血坏死是股骨头部分或完全的慢性缺血导致的骨组织和髓腔的细胞发生的自发性坏死,严重可导致造成关节面的骨折和塌陷。晚期患者临床多采用人工髋关节置换的方法治疗。但目前针对早期缺血坏死病变,尚缺乏确切有效的治疗方法。富含血小板血浆(PRP),含有大量的各种活性生长因子,它们之间的联合作用能促进多种组织的修复和血管形成,但其持续释放时间较短;肝素结合纤维蛋白(HCF)作为载体与PRP结合后,能结合生长因子,稳定持续的将它们释放,并提供修复支架的作用。治疗早期股骨头缺血坏死是一个难题,目前实验均难以在修复骨组织的同时,很好的血管再生。[目的]本实验使用肝素结合纤维蛋白(HCF)作为富含血小板血浆(PRP)的载体,验证其对骨髓间充质干细胞的成骨分化和血管内皮细胞分化的促进作用。将HCF-PRP加入激素诱导兔股骨头坏死模型中,研究HCF-PRP对股骨头缺血坏死的骨修复和血管再生能力,验证其治疗股骨头缺血坏死的有效性,并探讨其作用机理,从而为临床治疗早期股骨头缺血坏死开拓新的方法。[方法]本实验将按照以下方法验证HCF-PRP的在股骨头坏死中的修复作用:1.ELISA方法检测所制HCF-PRP中生长因子的释放动力学。从兔骨髓中分离出骨髓间充质干细胞(BMSC),用流式细胞技术鉴定细胞表型。将BMSC成骨诱导分化,分为三组分别加入HCF,PRP和HCF-PRP培养14天,通过茜素红染色对比研究细胞成骨分化的情况,并通过定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测BMCSs中成骨分化基因(ALP,OCN,18SrRN)和血管分化基因(VEGF)的表达,来观察BMSC成骨分化和成血管化的能力。2.取新西兰大耳兔,予以注射脂多糖和地塞米松,以构建股骨头缺血坏死的动物模型,并于药物注射8周后,通过X线片和MRII检查以及组织学染色判断股骨头缺血坏死情况,筛选出建模成功兔,计算动物模型造模成功率。3.将建模成功实验动物(n=27)随机分成5组,A组(n=3)为空白对照组,B组(n=6)单纯行右(R侧)后肢股骨头钻孔术,C组(n=6)行右后肢股骨头钻孔+ HCF植入D组(n=6)行右后肢股骨头钻孔+PRP植入,E组(n=6)行右后肢股骨头钻孔+HCF-PRP植入。每组兔左(L侧)后肢均不做任何处理,进行对照研究。治疗后第8周,行MRI影像学检查,然后取兔股骨头标本分别做组织HE染色及特异抗体VEGF、vWF、SMα免疫组织化学染色,然后进行病理学观察、微血管计数及VEGF、vWF、SMα表达半定量分析,来观察组织内血管增生情况。利用SPSS17.0统计学软件对上述资料进行统计分析和比较,P0.05为差异有统计学意义,P0.01为差异有显著统计学意义。[结果]1.以表皮生长因子(EGF)为代表,它在HCF-PRP中的释放持续时间(94±0.2%,8天)比PRP(98±0.4%,4天)更长。实验分离培养的BMSC经过流式细胞仪鉴定,特异性表型抗体CD29和CD90的均高表达(95%)。2.BMSC诱导分化后茜素红染色结果,HCF-PRP组平均光密度值大于PRP和HCF组(P0.05)。定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测试验中,HCF-PRP组骨向分化基因(ALP,OCN,18SrRN)和血管分化基因(VEGF)的表达均高于PRP组、HCF组和对照组(P0.05)。3.在建立激素诱导兔股骨头缺血坏死模型中,实验组X光线片股骨头坏死率为71.88%,MRI检测为90.63%,组织染色中空骨陷窝率为35.4±1.8%,对照组8.2±1.5%(P0.05)。4.动物分组实验中组间R侧微血管计数两两比较,E组MVC最多(P0.01),D组次之(P0.01),A组最少(P0.05),B、C组介于A、D组之间(P0.05);组间L侧MVC两两比较,无差异(P0.05);组内R侧与L侧MVC相比,A组无差异(P0.05),B、D、E组差异显著(P0.01),C组有差异(P0.05)。PCR检测VEGF、vWF、SMα表达量比较,E组R侧最高(P0.05),D组R侧次之(P0.05),A组双侧及B、C、D、E组L侧最少(DvsAE,P0.05,其余P0.05),B、C组R侧介于之间(P0.05)。兔股骨头组织内微血管数与VEGF表达量之间呈显著相关,相关系数0.956,P0.01。E组(HCF-PRP)明显促进股骨头坏死中血管修复再生。[结论]1.HCF-PRP能够稳定生长因子,延长它的释放时间。它能促进BMSC细胞的成骨分化,并有促进向血管分化的能力。2、激素联合内毒素注射可以成功建立股骨头缺血坏死动物模型,且成功率较高;3、在激素联合内毒素诱发的兔股骨头缺血坏死模型中,通过钻孔植入HCF-PRP,能促进组织中骨组织修复,血管再生,加速侧枝循环建立,促进缺血坏死股骨头组织修复。


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