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伴发脊髓空洞的脊柱侧凸形成机制及BMSCs移植干预实验研究

赵智  
【摘要】:[目的]脊髓空洞是脊柱侧凸最常见的椎管内伴发畸形。然而,二者间存在何种联系目前尚不明晰。脑脊液流体动力学异常、脊髓神经细胞凋亡是脊髓空洞形成的重要原因,而其在伴发脊髓空洞脊柱侧凸的形成、进展过程中的作用有待深入探索。本研究基于kaolin诱导建立的伴发脊髓空洞脊柱侧凸兔模型,拟从正、反两方面探讨脑脊液流体动力学改变、脊髓神经细胞凋亡在该病理过程中的作用,以期为研究伴发脊髓空洞脊柱侧凸发病机制,探索脊柱侧凸与伴发脊髓空洞间的深层次关系,研发脊柱侧凸对因治疗的新策略和新方法提供科学依据。[方法]1.脊髓空洞脊柱侧凸形成与脑脊液流体动力学变化的相关性研究:随机入选50只2-3月龄日本大耳兔,其中40只以kaolin溶液于第7颈椎水平行硬膜下至脊髓内分层注射,诱导建立伴发脊髓空洞脊柱侧凸兔模型;其余10只仅行生理盐水注射后纳入对照组。造模前及造模后4周、6周、8周、10周、12周多时相点,通过脊柱全长X线片及脊髓核磁共振扫描(MRI)动态观察脊柱侧凸/脊髓空洞形成和进展情况,确定脊柱侧凸/脊髓空洞形成最早时相点;同时,通过相位对比电影磁共振技术(PC-cine MRI)动态检测该病程中脑脊液峰值流速变化情况。根据造模后12周时脊柱侧凸形成与否,将实验兔分为2组后对比脑脊液峰值流速变化差异,分析其与脊柱侧凸形成与进展间的关系。2.伴发脊髓空洞脊柱侧凸形成前期脊髓神经细胞凋亡及椎旁肌失神经支配研究:另随机入选25只2-3月龄日本大耳兔,20只行kaolin诱导造模,余5只为空白对照。分别于造模前、造模后3天、2周、4周、6周颈-胸段脊髓组织及中胸段双侧椎旁肌组织取材:对脊髓组织行HE染色组织学观察及TUNEL 比色法动态检测脊髓神经细胞凋亡,计算凋亡指数;对椎旁肌行HE染色组织学观察、Masson染色对比双侧椎旁肌纤维化程度,并检测和对比双侧椎旁肌乙酞胆碱受体γ亚基(AChR-γ)mRNA和蛋白表达差异。3.骨髓基质干细胞(BMSCs)改善脊髓神经细胞凋亡的体外实验研究:在兔脊髓神经细胞分离、原代培养的基础上,采用血清剥夺法对细胞进行去血清培养,构建脊髓神经细胞凋亡模型;并将分离培养后获取的兔BMSCs与凋亡脊髓神经细胞进行嵌入式共培养,流式细胞仪检测并计算脊髓神经细胞凋亡指数变化,CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。4.BMSCs移植抑制伴发脊髓空洞脊柱侧凸形成的实验研究:再随机入选34只2-3月龄日本大耳兔,均行kaolin诱导造模。对其中17只实验兔于造模后2周、4周以兔BMSCs于原造模术区行两次脊髓内注射移植,其余兔同法行生理盐水注射后作为对照。移植干预完成后,于kaolin诱导造模后6周TUNEL 比色法检测并计算脊髓神经细胞凋亡指数。同时,于kaolin诱导造模后6周、12周,X线片及MRI观察BMSCs移植干预后脊柱侧凸/脊髓空洞形成情况,PC-cine MRI检测脑脊液流体动力学变化情况。[结果]1.50只实验兔中,47只存活至造模后12周:在接受kaolin诱导造模的40只实验组兔中,37只(92.5%)存活至造模后12周。kaolin诱导后6周时,部分实验兔开始形成脊柱侧凸和/或脊髓空洞;至造模后12周时,脊柱侧凸发生率为73.0%,脊髓空洞发生率为70.3%,侧凸与空洞伴发率为54.1%。对照组兔无脊柱侧凸或脊髓空洞形成。在脊柱侧凸兔中,造模后脑脊液峰值流速逐渐降低:与未形成脊柱侧凸兔比较,从kaolin诱导后4周开始脑脊液峰值流速差异渐趋明显;且脑脊液峰值流速减慢程度与kaolin诱导后12周时最终形成的脊柱侧凸Cobb角呈显著正相关(P0.001)。2.通过kaolin诱导后不同时相点脊髓HE染色,可观察到以早期脊髓实质炎症反应、血管周围间隙扩张、室管膜细胞脱落、中央管扩张为特征的空洞形成病理变化过程;同时,在脊髓造模术区及其邻近区域,从kaolin诱导后3天至6周,脊髓神经细胞凋亡指数呈进行性升高趋势。双侧椎旁肌HE染色可见以早期炎症反应和纤维化为特征的病理改变;Masson染色显示双侧椎旁肌纤维化程度呈对称性进展(P0.05);且双侧椎旁肌AChR-γ mRNA和蛋白表达变化无差异(P0.05)。3.去血清培养24h至48h脊髓神经细胞凋亡指数逐渐上升;至72h,凋亡指数急剧上升,提示细胞损伤过重,故选择去血清培养48h的兔脊髓神经细胞作为凋亡模型进行干预。将兔BMSCs作为辅助细胞与去血清培养48h的凋亡兔脊髓神经细胞共培养后,可有效降低脊髓神经细胞凋亡指数(8.60%± 0.30%vs 6.13%±0.12%,P0.01),并促进细胞增殖(1.52±0.27 vs 0.73 ± 0.20,P0.05)。4.将BMSCs移植入受试兔体内后,至kaolin诱导后6周,造模术区脊髓神经细胞凋亡指数低于对照组(13.04%±1.39%vs 26.57%±5.72%,P0.05);在术区邻近区亦呈现类似趋势(17.79%±1.57%vs 26.08%±3.04%,P0.05);脊柱侧凸(25.0%vs 33.3%)、脊髓空洞(16.7%vs 33.3%)发生率、脊柱侧凸与脊髓空洞伴发率(8.3%vs 25.0%)均较盐水对照组降低。至kaolin诱导后12周,经BMSCs移植干预实验兔脊柱侧凸(66.7%vs 75.0%)、脊髓空洞(50.0%vs 66.7%)发生率、脊柱侧凸与脊髓空洞的伴发率(41.7%vs 50.0%)仍有所减低,但下降趋势不如kaolin诱导后6周时明显。实验兔的脑脊液峰值流速较盐水对照组亦有改善,并以kaolin诱导后6周时更加明显(P0.05),但第6周和第12周CSF峰值流速无差异(P0.05)。[结论]1.通过kaolin硬膜下至脊髓内分层注射可成功建立稳定、平行性良好的伴发脊髓空洞脊柱侧凸兔模型,可为脊柱侧凸发病机制研究提供关键技术和良好的实验支撑平台。2.脊柱侧凸与伴发脊髓空洞间并非单纯因果关系,脑脊液流动的持续低动力学改变在伴发脊髓空洞的脊柱侧凸形成、进展过程中扮演重要角色。3.脊髓神经细胞凋亡和脑脊液流体动力学改变并非通过诱发双侧椎旁肌非对称性失神经支配导致脊柱侧凸形成。4.BMSCs移植可对脊髓神经细胞发挥保护作用,抑制其过度凋亡;并可能通过改善脑脊液流动状态,抑制脊柱侧凸及伴发脊髓空洞的发生。


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