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成纤维细胞联合血管内皮细胞促进脂肪干细胞增殖及成骨分化研究

杨桂然  
【摘要】:目的:为进一步优化组织工程骨仿生性能,本研究拟通过将具有优良增殖分化性能、分泌合成胶原能力、含多种调控因子的成纤维细胞(FB)与血管内皮细胞(VECs)联合共培养脂肪间充质干细胞(ADSCs),探讨FB对ADSCs的作用,明确FB是否能加强VECs的直接诱导作用,为解决组织工程骨形成缓慢、血管化缓慢等问题以及临床骨缺损治疗方案提供捷径和新思路。方法:①将血管内皮细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞三种细胞株分别体外培养,并通过细胞形态学及表面标记进行检测和鉴定,确定其各自细胞生物学特性;②将细胞分为四组:ADSCs组、ADSCs+VECs共培养组、ADSCs+FB共培养组、ADSCs+VECs+FB共培养组,分别倒置显微镜下观察细胞的形态变化;③CCK-8法绘制出各组细胞的生长曲线,比较各组细胞增殖情况;④共培养第7、14、21、28天各组进行茜素红染色、ALP染色,分别进行定性及定量检测;⑤共培养第3周行Western blot检测各组BMP-2蛋白水平表达;⑥共培养第3周行RT-PCR检测成骨标志基因(ALP、OCN)mRNA的表达,以评估共培养体系的成骨分化能力。结果:①三种细胞的形态及增殖情况良好,ADSCs的CD90、CD105(+),成骨诱导(+);VECs的CD133、vWF(+);FB的Vinmintin(+);②ADSCs+VECs+FB共培养组培养至14天时,细胞之间出现许多突触相互连接,部分细胞融合成团块状,呈巢状分布,而ADSCs单独组细胞形态单一,未见细胞团出现;③生长曲线可见各组细胞吸光度逐渐升高,各组生长曲线形态基本相同,ADSCs+VECs+FB共培养组OD值最高;④茜素红染色定量分析第14天时,ADSCs组与ADSCs+VECs组比较、ADSCs+FB组与ADSCs+VECs+FB组比较无明显差异(P0.05),第21天时,除ADSCs组与ADSCs+VECs组比较无明显差异外(P0.05),其余各时间、各组组间两两比较均有统计学差异(P0.05);ALP染色定量分析各时间段组间均有统计学差异(P0.05);除第21天时,B组与C组比较无明显差异外(P0.05),其余各个时间点、各组组间两两比较均有统计学差异(P0.05);⑤Western Blot结果显示四组细胞均有表达,ADSCs+FB组和ADSCs+VECs+FB组的表达较明显,且ADSCs组与ADSCs+VECs组相比无明显差异(P0.05),其余各组组间两两比较均有统计学差异(P0.05);⑥RT-PCR结果显示对于ALP mRNA的表达,ADSCs组与ADSCs+FB组相比无明显统计学差异外(P0.05),其余各组相比均有统计学差异(P0.05),对于OCN mRNA的表达,除ADSCs组与ADSCs+VECs组相比无明显统计学差异外(P0.05),其余各组相比均有差异(P0.05)。结论:①在共培养条件下VECs能在体外无其他条件诱导情况下直接促进ADSCs增殖并向成骨细胞分化;②FB和ADSCs体外共培养条件下促进ADSCs成骨分化的能力比VECs强,但促其增殖效果不如VECs;③FB联合VECs与ADSCs共培养既能使ADSCs大量增殖,又能促进其快速而高效向成骨细胞分化。


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