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大麻二酚(CBD)改善脑损伤血脑屏障渗透性的研究

蒋鸿雁  
【摘要】:[目的]1.探索创伤性脑损伤(TBI)致伤后8 h、24 h、2d、3d、5 d、7 d大鼠脑组织含水量情况,确定脑水肿的高峰期;2.探索大麻二酚(CBD)梯度剂量(5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg)对TBI大鼠的干预作用,确定CBD最佳干预剂量;3.探索CBD最佳干预剂量对TBI大鼠血脑屏障(BBB)渗透性的改善作用。[方法](1)采用“改良Feeney自由落体撞击法,建立大鼠TBI模型”,随机分为TBI 致伤后 8h、24h、2d、3d、5d、7d 组,同时设置 Sham 组(n=3),通过计算干/湿重比值,确定脑水肿发生的高峰期。(2)脑水肿发生的高峰期确定为 TBI 后 24 h,设置 Sham 组、TBI+vehicle 组、TBI+CBD 5 mg/kg 组、TBI+CBD 10 mg/kg 组和 TBI+CBD 20 mg/kg 组(n=3)[CBD 30 mg/kg 因有致死情况而被剔除],通过行为学、形态学、分子生物学和ELISA实验,探索CBD最佳干预剂量。(3)CBD最佳干预剂量确定为10 mg/kg,设置Sham组、TBI+vehicle组、TBI+CBD 10mg/kg组(n=3),通过形态学、分子生物学和伊文思蓝染色实验,探索CBD 10 mg/kg对TBI后BBB渗透性的改善作用。[结果]1 探索TBI后脑水肿高峰期干/湿重比结果显示:与Sham组相比,TBI致伤后随时间点推移(8 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d)大鼠脑组织含水量呈现出上升趋势,均有统计学差异(P0.05)。其中TBI后24 h的脑组织含水量达到高峰。2 探索CBD最佳干预剂量2.1 改良神经功能缺损评分(mNSS)(1)与Sham组相比,TBI组大鼠mNSS评分明显增高(P0.01);(2)与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组的mNSS评分最低(P0.05)。2.2 ELISA实验(S100-β为脑损伤标记物)(1)与Sham组相比,TBI组S100-β含量明显增加(P0.001);(2)与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组S100-β含量最低(P0.001)。2.3干/湿重比(1)Sham组大鼠的左侧脑组织(损伤对侧)和右侧脑组织(损伤侧)含水量无明显变化;(2)TBI组损伤侧脑组织含水量较损伤对侧增加(P0.05);(3)在大鼠右侧(损伤侧)脑组织中:①与Sham组相比,TBI组脑组织含水量增多(P0.05);②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10mg/kg组脑组织含水量最低(P0.05)。2.4 HE染色(大鼠损伤侧皮质区)(1)Sham组神经元形态正常,着色均匀,细胞结构完整,轮廓清晰,胞质丰富,胞核清晰、核大而圆、位于细胞中央,核仁明显;(2)与Sham组相比,TBI组神经元出现病理学变化,即细胞肿胀,细胞核深染,轮廓不清,胞质溶解,出现空泡;(3)与TBI组相比,CBD 5 mg/kg干预组仍有神经元胞体肿胀,细胞核深染,胞质溶解等病理学改变,CBD 10 mg/kg与CBD 20 mg/kg干预组神经元胞体仍有轻度肿胀。2.5 尼氏染色(大鼠损伤侧皮质区)(1)Sham组神经元形态正常,细胞轮廓清晰,尼氏体丰富,染色均匀,细胞核染成淡紫色、呈圆形、位于细胞中央,核仁明显;(2)与Sham组相比,TBI组神经元的细胞核和核仁消失,胞体浓缩呈三角形,出现大量的固缩性坏死(P0.01);(3)与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组的固缩性坏死神经元数量最少(P0.01)。2.6 免疫荧光单标染色(大鼠损伤侧皮质区)(1)星形胶质细胞标记物GFAP。1)GFAP阳性细胞的形态学变化:①Sham组GFAP阳性表达的星形胶质细胞胞体较小、突起呈细长状;②与Sham组相比,TBI组星形胶质细胞胞体变大、突起增多和变粗,呈激活状态;③与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 5 mg/kg组星形胶质细胞的激活状态出现减弱,CBD 10 mg/kg组星形胶质细胞激活状态减弱明显,CBD 20 mg/kg干预组星形胶质细胞形态变化和CBD 10 mg/kg干预组近似。2)对GFAP阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组GFAP的荧光强度较Sham组增强(P0.05);②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组GFAP的荧光强度较TBI组明显减弱(P0.05)。(2)水通道蛋白AQP4。1)AQP4阳性表达的形态学变化:①Sham组AQP4阳性表达在细胞膜上,呈中空小管状结构;②与Sham组相比,TBI组AQP4阳性表达的形态变化不大;③与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,AQP4阳性表达的形态仍呈中空小管状。2)对AQP4阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组AQP4的荧光强度较Sham组增强(P0.05);②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg组AQP4的荧光强度较TBI组明显减弱(P0.05)。2.7 Western blotting实验(大鼠损伤侧皮质区)(1)GFAP、AQP4、TNF-α和IL-1β的蛋白表达:①与Sham组相比,TBI组GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达升高(P0.05),AQP4的蛋白表达变化不具有统计学意义(P0.05);②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,除了 TNF-α的蛋白外,CBD 10 mg/kg组GFAP、AQP4和IL-1β的蛋白表达最低(P0.05)。(2)Claudin-5 和 Occludin 的蛋白表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5和Occludin的蛋白表达变化无明显差异(P0.05);②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,Claudin-5和Occludin的蛋白表达变化无明显差异(P0.05)。2.8 RT-PCR实验(大鼠损伤侧皮质区)(1)GFAP、AQP4、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 GFAP、AQP4、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达升高(P0.05);②与 TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,除了 TNF-α的mRNA外,CBD 10 mg/kg组GFAP、AQP4 和 IL-1β 的 mRNA 表达最低(P0.05)。(2)Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5和Occludin的mRNA表达降低(P0.05);②与TBI组相比,不同剂量CBD干预组中,CBD 10 mg/kg 组 Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA 表达最高(P0.05)。3 探索CBD对BBB渗透性的改善3.1 免疫荧光单标染色(大鼠损伤侧皮质区)(1)星形胶质细胞标记物GFAP。1)GFAP阳性表达的星形胶质细胞形态学变化:①Sham组星形胶质细胞胞体小、突起细长、突起末端的足板贴附在血管壁上;②与Sham组相比,TBI组星形胶质细胞呈激活状态,胞体大、突起增多、突起末端的足板肿胀,贴附在血管处有断裂;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组星形胶质细胞的激活状态减弱。2)对GFAP阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组GFAP荧光强度较Sham组增强(P0.05);②CBD 10 mg/kg干预组GFAP荧光强度较TBI组减弱(P0.05)。(2)紧密连接蛋白Claudin-5。1)Claudin-5阳性表达的形态学变化:①Sham组Claudin-5的阳性表达的形态多呈线条状;②与Sham组相比,TBI组Claudin-5阳性表达的线条状发生断裂,多呈点状;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组Claudin-5阳性表达的形态有所恢复,接近正常的线条状。2)对Claudin-5阳性表达的平均荧光强度进行定量分析发现:①TBI组Claudin-5荧光强度较Sham组明显减弱(P0.01);②CBD 10 mg/kg干预组Claudin-5荧光强度较TBI组明显增加(P0.05)。(3)紧密连接蛋白Occludin。1)Occludin阳性表达的形态学变化:①Sham组Occludin的阳性表达出现在细胞之间呈线条状;②与Sham组相比,TBI组Occludin阳性表达的形态发生改变,线条状不再连续,呈断裂或点状;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组Occludin阳性表达的形态有所恢复。2)对Occludin阳性表达的平均荧光强度进行定量分析:①TBI组Occludin荧光强度较Sham组明显减弱(P0.01);②CBD 10 mg/kg干预组Occludin荧光强度较TBI组增加(P0.05)。3.2 免疫荧光双标染色(大鼠损伤侧皮质区)(1)星形胶质细胞标记物GFAP。1)GFAP阳性细胞的形态学变化:①在Sham组中,血管处GFAP 阳性表达的星形胶质细胞胞体小、突起细长、突起末端的足板贴附在血管壁上;②与Sham组相比,TBI组星形胶质细胞呈激活状态,胞体大,突起增多,突起末端的足板肿胀,贴附在血管处出现断裂;③与TBI组相比,CBD 10mg/kg干预组星形胶质细胞的激活状态减弱。(2)水通道蛋白AQP4。1)AQP4阳性表达的形态学变化:①Sham组AQP4阳性表达在细胞膜上,呈中空小管状结构;②与Sham组相比,TBI组AQP4阳性表达的形态变化不大;③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组AQP4阳性表达的形态仍呈中空小管状。(3)对GFAP与AQP4 阳性共表达的平均荧光强度进行定量分析:①在Sham组中,GFAP(绿色)与AQP4(红色)存在共表达(黄色);②TBI组GFAP与AQP4共表达荧光强度较Sham组增强(P0.01);③CBD 10 mg/kg干预组GFAP与AQP4共表达荧光强度较TBI组减弱(P0.05)。3.3 Western blotting实验(大鼠损伤侧皮质区)(1)GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达:①与Sham组相比,TBI组GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达明显增加(P0.05);②与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组GFAP、TNF-α和IL-1β的蛋白表达明显降低(P0.05)。(2)Claudin-5 和 Occludin 的蛋白表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5和Occludin的蛋白表达明显降低(P0.05);②与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组Claudin-5与Occludin的蛋白表达增加(P0.05)。3.4 RT-PCR实验(大鼠损伤侧皮质区)(1)GFAP、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组GFAP、TNF-α和IL-1 β的mRNA表达显著增加(P0.05);②与TBI组相比,CBD 10 mg/kg 干预组 GFAP、TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达明显下降(P0.05)。(2)Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA 表达:①与 Sham 组相比,TBI 组 Claudin-5的mRNA表达无明显差异(P0.05),Occludin的mRNA表达出现下降(P0.05);②与 TBI 组相比,CBD 10 mg/kg 干预组 Claudin-5 和 Occludin 的 mRNA表达显著上升(P0.05)。3.5伊文思蓝示踪(EB)染色(大鼠损伤侧皮质)(1)对脑组织外观观察:Control组未见蓝染;Sham组出现少许蓝染;TBI组蓝染明显;CBD 10 mg/kg干预组蓝染明显;(2)对损伤侧皮质区脑组织EB含量进行检测:①与Control组相比,Sham组的EB含量稍微有升高,但是无统计学意义(P0.05);②与Sham组相比,TBI组的EB含量明显升高(P0.01);③与TBI组相比,CBD 10 mg/kg干预组的EB含量明显下降(P0.05)。[结论]1.TBI大鼠的脑水肿高峰期发生在TBI致伤后24 h;2.在CBD梯度剂量中,CBD 10 mg/kg为本实验的最佳干预剂量;3.CBD 10 mg/kg能改善TBI大鼠神经功能缺损,减弱星形胶质细胞激活和增加紧密连接蛋白表达,从而改善BBB结构完整性和渗透性,减轻TBI后继发性脑水肿。


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