大麻二酚对人真皮成纤维细胞光老化的干预作用和机制研究

【摘要】：[目的]探讨大麻二酚(CBD)对人真皮成纤维细胞(HDFa)光老化衰老表型的预防和治疗作用及可能机制。[方法]本研究选择生长状态良好的HDFa细胞,采用剂量为60、120、180、240mJ/cm2 UVB单次照射。照射后检测细胞增殖能力、活性氧和active caspase-3表达选择合适的UVB照射剂量,进一步检测该剂量照射后细胞周期、氧化还原平衡、炎症因子和细胞外基质成分等衰老表型,再进行后续CBD给药实验。在UVB照射HDFa前后分别给予不同浓度CBD处理6小时,观察评估相关衰老表型变化。通过RT-qPCR检测衰老相关信号通路(p53、p21和p16)、MAPK信号通路、转录因子AP-1和NF-κB探讨有关机制。[结果]1、180mJ/cm2UVB是最佳照射剂量,该剂量下UVB照射后能够降低细胞增殖能力,细胞内活性氧水平明显上升且提示凋亡active caspase-3表达不显著升高。UVB照射后成纤维细胞出现光老化衰老表型:细胞S期阻滞,DNA合成障碍,氧化还原平衡失调。细胞分泌炎症因子增加,MMP-1表达增加,促进细胞外基质成分降解。I型胶原蛋白和弹性纤维蛋白原在mRNA水平表达下调,HDFa中I型胶原蛋白表达下降,弹性纤维长宽比减小。2、CBD促进DNA合成,CBD对p53、p21和p16调节作用与给药方式有关。EdU掺入实验结果显示,与UVB照射组相比,CBD处理后EdU阳性细胞率增加。RT-qPCR显示,CBD预处理组的p53、p21和p16基因mRNA水平未见明显变化。而CBD处理组的p53、p21和p16基因mRNA表达水平明显下调。在本实验中CBD未能缓解UVB照射后诱导的细胞周期阻滞。3、CBD调节氧化还原平衡,促进细胞增殖活力。DCFH-DA探针实验结果显示,CBD处理后,细胞内活性氧水平下降。酶活力检测结果显示,与UVB照射组相比,CBD预处理抑制SOD、CAT酶活力下降,抑制GSH-Px酶活力上升,并减少MDA含量。CBD处理组恢复SOD和GSH-Px酶活力,也减少MDA含量,CBD预处理组和处理组均可促进细胞增殖。4、CBD下调MMP-1表达,上调I型胶原和弹性纤维蛋白原表达。RT-qPCR显示,与UVB照射组相比,CBD预处理组和CBD处理组的I型胶原和弹性纤维蛋白原mRNA表达水平明显上调,MMP-1的mRNA表达水平明显下调,TIMP-1的mRNA水平未见明显变化。细胞免疫荧光结果和ELISA结果与RT-qPCR 结果一致。5、CBD下调MAPK信号通路和转录因子mRNA表达水平,抑制光老化相关炎症反应。RT-qPCR显示,与UVB照射组相比,CBD处理后,下调MAPK信号通路和转录因子AP-1和NF-κB基因的mRNA水平表达。ELISA结果显示,CBD抑制下游炎症因子TNF-α和IL-6分泌。[结论]1、180mJ/cm2剂量下UVB照射可成功构建皮肤成纤维细胞光老化模型。为探讨抗氧化药物对光老化成纤维细胞干预作用奠定基础。2、在HDFa光老化模型中,CBD通过恢复抗氧化酶活力,清除脂质过氧化物发挥抗氧化作用。同时,CBD通过下调MAPK信号通路和转录因子(AP-1和NF-κB)mRNA表达,抑制TNF-α和IL-6分泌,发挥抗炎作用。此外,CBD下调MMP-1表达,减少UVB对ECM主要成分的降解,并促进I型胶原和弹性纤维蛋白原表达。3、CBD通过下调p53,p21和p16 mRNA表达,促进DNA合成,但该效应与给药方式有关。