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催产素预处理减轻冠状动脉内皮功能障碍大鼠心肌缺血/再灌注损伤机制研究

王默  
【摘要】:第一部分建立冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏灌注模型[目 的]在Langendorff灌注模型的基础上,利用Triton X-100,尝试建立成功率更高,对鼠心功能影响更少,心律失常发生率更小的冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心肌灌注模型。[方法]选取SD大鼠,随机分为2组(N=6只/组):CK组和ED组。离体鼠心跳动达标后灌注K-H缓冲液20min,(CK组:注入生理盐水10min,ED组:注入浓度为0.01%Triton X-100 10 min,随后K-H缓冲液灌注140 min。在T0和T1记录CPP降低率,在T0、T1、T2、T3、T4和T5记录血流动力学变化指标:LVSP、LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVDP,计算心率失常指数,搜集心肌损伤标志物hs-cTnT,TTC法检测心肌梗死面积,术后解剖冠脉扫描电镜观察内皮细胞形态变化。[结 果]CPP变化:注射组胺的情况下,与T1时间点CK组CPP降低率相比,ED组离体鼠心CPP降低率有明显的下降。硝普钠注射各组鼠心造成CPP下降程度无统计学差异。血流动力学变化指标、心率失常指数、心肌损伤标志物、梗死面积:两组鼠心各时间点组间及组内各项指标无统计学差异。扫描电镜下冠脉内皮形态:CK组冠脉内皮呈叠瓦状排布,形态完整,连续且光滑;ED组冠脉内皮粗糙杂乱,多有破损,露出内皮下层结构。[结 论]Triton X-100试剂可以成功的造成离体大鼠心脏内皮功能障碍,不影响心肌细胞功能。冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏模型制作成功。第二部分催产素预处理对冠脉内皮功能障碍的大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响[目 的]在第一部分实验基础上,研究催产素预处理对于冠脉内皮功能障碍的大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响。比较血流动力学、心肌损伤标志物和梗死面积变化和电镜下冠脉内皮形态,探索催产素预处理是否能减轻存在内皮功能障碍大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤。[方法]选取SD大鼠,随机分为6组(N=10只/组):CK组、I/R组、OT-I/R组、ED组、ED-I/R组、OT-ED-I/R组。离体鼠心跳动达标后灌注K-H缓冲液20 min。CK组:注入生理盐水10 min;ED处理:注入浓度为0.01%Triton X-100 10 min;OT处理:注入催产素(0.01 μmol/L)40 min;I/R处理:缺血30 min,再灌注60 min。在T1和T5记录CPP降低值,在T0、Tl、T2、T3、T4和T5记录血流动力学变化指标:LVSP、LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVDP、RPP、SI,计算心率失常指数,搜集心肌损伤标志物hs-cTnT,TTC法检测心肌梗死面积,术后解剖冠脉扫描电镜观察内皮细胞形态变化。[结 果]CPP变化:注射组胺的情况下,与T5时间点CK组CPP降低率相比,T5时间点I/R组和OT-I/R组、T1和T5时间点ED组、ED-I/R组、ED-OT-I/R组CPP有显著下降;与T5时间点I/R组CPP降低率相比,OT-I/R组CPP降低率有显著上升;与T5时间点L/R组CPP降低率相比,ED组、ED-I/R组和ED-OT-I/R组CPP降低率有显著下降。硝普钠注射各组鼠心造成CPP下降程度无统计学差异。各组离体鼠心在T0-T5时间点HR无统计学差异。与CK组相比,ED组各项血流动力学指标无统计学差异;与CK组相比,I/R组、OT-I/R组、ED-I/R组与ED-OT-I/R组复灌后各时间点LVDP、±dp/dtmax、RPP下降,心率失常指数、hs-cTnT、SI、梗死面积上升;与I/R组相比,OT-I/R组复灌后各时间点LVDP、±dp/dtmax、RPP上升,心率失常指数、hs-cTnT、SI、梗死面积下降;与ED-I/R组相比,ED-OT-I/R组复灌后各时间点LVDP、±dp/dtmax、RPP上升,心率失常指数、hs-cTnT、SI、梗死面积下降;OT-I/R组与OT-ED-I/R组各项指标无统计学差异。扫描电镜下冠脉内皮形态:CK组:内皮细胞基本完好,平整,内皮呈叠瓦状排列,无损伤。I/R组:内皮细胞破裂,完整性被破坏。OT-I/R组:内皮损伤程度减轻,有轻微的断层,孔洞。ED组、ED-I/R组、ED-OT-I/R组:内皮迁移、游离。异常杂乱,内皮几乎完全剥离,比I/R组更彻底。[结 论]催产素预处理能减轻离体鼠心受到的缺血/再灌注损伤,改善鼠心收缩和舒张功能,降低心率失常发生率及恶性程度,提升速率压力乘积,降低休克指数、心肌损伤标志物表达和梗死面积。此治疗作用在冠脉内皮功能完好和冠脉内皮功能障碍的大鼠离体心脏中同时存在,治疗效果没有区别。第三部分催产素预处理对大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤的治疗机制研究[目 的]在Transwell培养模型的基础上,建立大鼠冠脉内皮细胞和H9C2细胞共培养模型,观察催产素预处理对于大鼠冠脉内皮细胞和H9C2细胞的影响。在细胞层面和分子生物学水平探索催产素减轻心肌细胞和内皮细胞缺氧/复氧损伤的作用机制。[方法]大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞单独培养和Transwell共培养,分为8组:H组、C 组、H-H/R 组、C-H/R 组、C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R组。H组:H9C2细胞正常培养8h;C组:大鼠冠脉内皮细胞正常培养8h;H/R处理:细胞缺氧4h/复氧4h培养;OT处理:催产素(0.01 μmol/L)预处理细胞40 min。显微镜下观察细胞形态,CCK 8法检测细胞活力,ELISA法检测cTnT及eNOS,Griess法检测NO释放量。[结 果]显微镜下细胞形态:H组细胞生长健康,扁长梭形、形态大体一致分布均匀。C组细胞健康生长,呈铺路石状;H-H/R组细胞破裂变形;C-H/R细胞贴壁率下降,呈圆点状;H-C-H/R组中H9C2细胞形态与H-H/R组H9C2细胞形态相似;催产素处理组细胞形态均有改善。与 H 组相比,H-H/R 组、OT-H-H/R 组、C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R 组细胞活性下降,cTnT表达增加;与C组相比,C-H/R组细胞活性下降;与H-H/R组相比,OT-H-H/R组、OT-C-H-H/R组细胞活力上升,cTnT表达减少;与C-H-H-H/R组相比、OT-C-H-H/R组细胞活力上升,cTnT表达减少;与C-H/R组相比,OT-C-H/R组细胞活力上升;与OT-H-H/R组相比,OT-C-H-H/R细胞活力和cTnT表达无统计学差异。与H组相比,H-H/R组、OT-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量下降;与C组相比,C-H/R组eNOS表达和NO释放量下降,OT-C-H/R组、OT-C-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量上升;与OT-H-H/R组相比,OT-C-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量显著上升;与H-H/R组相比,OT-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量无统计学差异;与OT-C-H/R组相比,OT-C-H-H/R组细胞eNOS表达和NO释放量无统计学差异。[结 论]催产素预处理能够减轻H9C2细胞缺氧/复氧损伤。催产素预处理对于减轻H9C2细胞缺氧/复氧损伤的治疗作用,在H9C2单独培养和与大鼠冠脉内皮细胞共培养情况下没有区别。催产素预处理对于H9C2细胞治疗效果H9C2细胞缺氧/复氧损伤的治疗作用,与大鼠冠脉内皮细胞无关。催产素预处理能够增加大鼠冠脉内皮细胞的eNOS表达和NO释放,减轻缺氧/复氧损伤。第四部分ERK1/2通路在催产素预处理减轻大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤中机制研究[目 的]在Transwell培养模型的基础上,建立大鼠冠脉内皮细胞和H9C2细胞共培养模型,利用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126,探索ERK1/2通路在催产素预处理减轻大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞共培养缺氧/复氧损伤中机制作用。[方 法]大鼠冠脉内皮细胞与H9C2细胞单独培养和Transwell共培养,分为6组:H组、H-H/R 组、OT-H-H/R 组、OT-H-H/R-U0126 组、OT-C-H-H/R 组、OT-C-H-H/R-U0126组。H组:H9C2细胞正常培养8 h;H/R处理:细胞缺氧4 h/复氧4 h培养;OT处理:催产素预处理细胞40 min。OT-U0126处理:催产素+U0126预处理细胞40 min。显微镜下观察细胞形态,CCK 8法检测细胞活力,ELISA法检测cTnT及eNOS,Griess法检测NO释放量,Western blot检测ERK1/2与p-ERK1/2 表达。[结 果]显微镜下细胞形态:H组细胞健康,呈长梭形,贴壁率正常;H-H/R细胞变形破裂,部分细胞漂浮在培养基上;OT-H-H/R组:细胞损伤程度较H-H/R组轻,细胞形态破坏较少;OT-H-H/R-U0126:细胞形态、受损情况大致与H-H/R组细胞相似。OT-C-H-H/R组:细胞受损程度减轻,状态明显改善,其中H9C2细胞形态与OT-H-H/R组相似。OT-H-H/R-U0126组:H9C2细胞形态与OT-H-H/R-U0126组细胞相似,内皮细胞与OT-C-H-H/R组相似。与 H 组相比,H-H/R 组、OT-H-H/R组、OT-H-H/R-U0126 组、OT-C-H-H/R组、OT-C-H-H-H/R-U0126组细胞活力明显下降,cTnT表达上升;与H-H/R组相比,OT-H-H/R组、OT-C-H-H/R组细胞活性上升,cTnT表达下降;与OT-H-H/R组相比,OT-H-H/R-U0126组细胞活性下降,cTnT表达增加;与OT-C-H-H/R组相比、OT-C-H-H/R-U0126组细胞活性下降,cTnT表达增加。与 H 组相比,H-H/R 组、OT-H-H/R 组、OT-H-H/R-U0126 组细胞的 eNOS表达和NO释放量减少;与H组相比,OT-C-H-H/R组和OT-C-H-H/R-U0126组细胞的eNOS表达和NO释放量上升;与OT-H-H/R组相比,OT-H-H/R-U0126组细胞的eNOS表达和NO释放量无统计学差异。与H/R组相比,H-H/R组细胞ERK1/2磷酸化率下降;与H-H/R组相比,OT-H-H/R 组 ERK1/2 磷酸化率上升;与 OT-H-H/R 组相比,OT-H-H/R-U0126 组细胞ERK1/2磷酸化率下降。[结论]催产素预处理可通过增加ERK1/2磷酸化减轻H9C2细胞受到的缺氧/复氧损伤,U0126能够阻断ERK1/2磷酸化从而极大削弱催产素的上述治疗作用。U0126不能影响冠脉内皮细胞eNOS表达和NO释放量,ERK1/2磷酸化没有参与催产素预处理改善冠脉内皮缺氧/复氧损伤的治疗作用。


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6 记者 聂翠蓉;心肌细胞可制成生物活性二极管[N];科技日报;2017年
7 朱广平 邹争春 记者 陈磊;颠覆教科书 成年心肌细胞能“再生”获证[N];科技日报;2017年
8 记者 李珩;首次揭示成年心肌细胞能再生[N];重庆日报;2017年
9 特约记者 邹争春 朱广平;成年心肌细胞也能再生[N];健康报;2017年
10 记者 胡德荣;未来服药可能让心肌细胞再生[N];健康报;2015年
11 记者 沈湫莎;服药就可能让心肌细胞再生[N];文汇报;2015年
12 见习记者 孙爱民;新技术实现大鼠多基因同步敲除[N];中国科学报;2013年
13 记者 黄辛;华东师大成功构建转基因“聪明大鼠”[N];科学时报;2009年
14 记者 张梦然;源自人体细胞的肠道成功移植给大鼠[N];科技日报;2017年
15 记者 冯卫东;大鼠研究显示孕期压力或可代代相传[N];科技日报;2014年
16 本报特约撰稿人 陆志城;用大鼠还是用小鼠?[N];医药经济报;2004年
17 记者胡德荣;心肌细胞能体外培养[N];健康报;2002年
18 通讯员 杨金 记者 宋黎胜;催产素可通过脑内投射影响情感[N];健康报;2020年
19 记者 孙国根;将大鼠基因的功能“对号入座”[N];健康报;2014年
20 记者 许琦敏;大鼠有望成实验室头号“明星”[N];文汇报;2010年
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