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Nm23-H1cDNA片段克隆及腺病毒载体的构建

孙钢  
【摘要】: 【目的】从正常人肝组织中克隆nm23-H1cDNA基因,构建腺病毒载体,为研究nm23-H1的生物学活性、突变特性及肿瘤基因治疗打下实验基础。 【方法】应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从正常人肝组织中扩增出nm23-H1cDNA,并将其连接到质粒pMD18-T上,经酶切鉴定、核苷酸序列测定,设计突变引物,进行PCR重叠延伸点诱导突变,克隆基因序列在Genbank上比较。与腺病毒穿梭质粒正向连接,构建腺病毒载体。 【结果】在正常人肝组织中克隆得到的nm23-H1cDNA片段经测序、比较,发现两个核苷酸与已知基因序列不同:213位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(213C→T),217位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(217C→T)。对应氨基酸发生突变:71位G甘氨酸变为A丙氨酸,73位的V缬氨酸变为I异亮氨酸。作PCR重叠延伸点诱导突变,克隆的基因经测序鉴定,与已知nm23-H1cDNA编码区基因100%符合,以此基因成功构建正向腺病毒穿梭质粒载体。 【结论】1.成功克隆出中国人nm23-H1cDNA基因,测序结果在基因库中比较,有两个核苷酸不同,无类似报道。2.采用PCR重叠诱导突变策略,设计引物,成功诱导突变,构建出pMD18-nm23-H1质粒载体。3.利用分子克隆技术,成功构建出正向重组腺病毒穿梭质粒载体。


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