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炎症反应在急性创伤性深静脉血栓形成中的变化和作用

张春强  
【摘要】: 目的动态检测大鼠急性创伤性深静脉血栓形成模型中股静脉基因的表达变化,全面筛选出参与该过程的差异表达基因,重点分析炎症相关基因的变化,并结合股静脉血管壁浸润的炎症细胞变化,血细胞分析,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的变化以及它们与血栓质量之间的相关性分析,探讨炎症反应在急性创伤性深静脉血栓形成中的变化和作用。 材料和方法1、采用直接钳夹大鼠双侧股静脉+双后肢人字石膏固定的方法建立急性创伤性深静脉血栓形成模型;根据观察时间和肉眼所见的血栓形成、变化情况将150只SD大鼠分为正常对照(A组)、创伤即刻(B组)、血栓形成初始期(C组)、血栓形成高峰期(D组)、血栓消退(E组)、血栓不消退(F组)和创伤无血栓形成(G组)七组;2、切取各大鼠的双侧股静脉血管,每条血管约0.5cm的部分用于HE染色光镜观察以确认上述分组的准确性并观察血管壁浸润的炎症细胞,剩余约3~4cm血管组织同组混合后采用Trizol一步法提取总RNA,经3%琼脂糖凝胶电泳和Lab-on芯片质检系统检验合格的各组RNA样品进行Affymetrix基因芯片检测;3、基因芯片检测结果采用倍数变化分析筛选出差异表达的基因并进行GO分类。4、以“Inflammation”为检索词从含15864个基因探针的芯片信息中挑选出炎症相关基因并进行倍数变化分析;5、再采用Clustersoftware 3.0软件对炎症基因进行聚类分析;6、采用RT-PCR技术上述7组备份RNA样品中对IL-1α、IL-1β、IL-6、Cinc2和IL-10进行测定,其结果与基因芯片数据进行比较;7、另150只大鼠同法建模和分组,在相应的时相点、采用心脏取血的方法抽取每只大鼠血液标本0.5ml用于血细胞分析检测,再取1.5ml血液标本进行离心获取血清用于TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的ELISA测定;8、纳入各组的大鼠切取腹股沟韧带~隐大静脉汇合部的股静脉血管通过测量其长度并称其重量计算出血栓质量(μg/cm),再采用Person相关分析来比较血栓质量与血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的相关性。 结果1、在该模型中,A组和B组均无血栓形成;至造模后2.5h,C组约3%股静脉内有血栓形成;在造模后25h,D组60%股静脉内有血栓形成;之后仍有3%的血栓形成,但大部分血栓形成后逐渐消退,至造模后72hr血栓消退率为60%,相应的血栓不消退率为40%;造模后整个过程中均无血栓形成的大鼠约占47%。2、纳入相应分组的各组血管组织肉眼和光镜的观察结果在血栓形成方面基本一致。3、在创伤性深静脉血栓形成过程中C组、D组和F组血管壁浸润的炎症细胞数量高于A组、B组、E组和F组,其中B组、C组以中性粒细胞为主;E组、F组和G以淋巴细胞为主。4、在该病理过程中共有2458个基因呈现差异性表达,其中上调基因1146个(Log_2 Ratio≥1且Change标注为Ⅰ),下调基因1312个(Log_2 Ratio≤-1且Change标注为D)。大部分差异表达的基因功能目前尚不清楚,已知功能基因主要为参与DNA依赖的转录调节基因、炎症、免疫相关基因、介导细胞内或细胞间信号传递的基因、参与纤溶—抗纤溶、凝血—抗凝血等基因。5、在Affymetrix Rat 230A芯片中共筛查出55个炎症相关基因,其中24个炎症相关基因在此过程中呈现差异性表达。6、IL-1α、IL-1β、IL-6、Cinc2和IL-10的RT-PCR检测结果与芯片检测结果变化趋势上基本一致,但RT-PCR的灵敏度大于基因芯片(Z=-3.785,P=0.00<0.05)。7、Cluster聚类分析结果显示55个炎症相关基因根据表达模式可分为三簇:第一簇包括IL-1、IL-6和Cinc2等,其表达水平与血栓形成和演化呈同向变化;第二簇包括IL-10和IL-2等,其表达水平随第一簇上调而上调,在血栓消退—不消退组的变化与第一簇基因相反;第三簇基因包括TNF、CD34等,他们的表达及变化与前两群基因不同。8、B组、C组、D组和F组血常规中WBC计数高于A组、E组和G组。9、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10因子的变化与其转录水平并非平行;TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10分别与血栓质量之间均无相关性(Pearson相关系数分别为0.14、0.4、0.39和0.22,p值均>0.05);血栓质量与IL-1β/IL-10之间的比值成正相关(Pearson r=0.87,p=0.01<0.05)。结论1、采用直接钳夹股静脉+双后肢人字石膏固定的方法可以成功建立TDVT动物模型。该模型造模方法简便、血栓发生率高,其发展变化过程与临床上血管直接损伤引发的急性DVT较相似;血栓形成多为完全性血栓,有利于分组的实施并保证分组的准确性;2、在急性TDVT过程中伴有急性炎症向慢性炎症转化的过程;3、急性TDVT是涉及炎症、免疫、纤溶-抗纤溶、凝血-抗凝血等多基因变化的疾病;4、创伤后炎症反应与深静脉血栓形成关系密切,炎症介质如IL-1α、IL-1β、IL-6等可能促进创伤性深静脉血栓的形成;相反,抗炎症介质如IL-10、IL-2等可能抑制创伤性深静脉血栓的形成;4、监测血清中IL-1β和Il-10的比值可间接反应创伤后深静脉形成的状态和预后;5、从发展的时间顺序、炎症相关基因和蛋白的变化与血栓形成的密切联系,以及炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6等对凝血、纤溶等系统的作用分析,本研究有力地支持了炎症是静脉血栓形成原因的观点,可作为下一步深入研究的方向。


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