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受体来源转染pBLAST2-hHGF质粒肝卵圆细胞对大鼠移植肝的影响

李铸  
【摘要】: 第一部分:大鼠原位肝移植模型的建立 目的:探讨大鼠肝移植模型的建立方法,为肝移植的相关研究提供稳定的模型基础。 方法:通过Kamada“二袖套法”,预实验时对SD大鼠实施了同种原位肝移植手术,正式实验时以雌性DA大鼠为供体,雌性Lewis大鼠为受体,对Lewis大鼠实施了原位肝移植手术,并观察大鼠术后存活率和并发症的发生情况。 结果:总共实施大鼠原位肝移植310例,在60例定型手术中,供体手术时间(20.5±4)min,供肝修整时间(8±3)min,受体手术时间(40±10.5)min,无肝期为(13.4±3)min,手术成功率为97.3%,一周存活率为92.5%。成功地建立了稳定的大鼠肝移植模型。 结论:大鼠原位肝移植模型的建立,需要一定的显微外科基础和熟悉大鼠的腹部解剖结构的前提下,经过4-6月的不间断训练,方能获得成功。正确的供肝灌注、严密的腹腔止血、熟练的显微血管缝合技术、尽量缩短的无肝期、完善的术中补液纠酸及术后复温是保证手术成功的关键。 第二部分:大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立、肝卵圆细胞分离、培养、鉴定及分化 目的:通过2-AAF/PH模型活化大鼠的肝卵圆细胞(HOC),并分离纯化和培养,在体外诱导HOC向肝细胞和胆管上皮细胞分化。 方法:采用雄性Lewis大鼠20只,饲喂2-AAF20mg/(kg.day)5天后,分组行2/3肝叶切除和肝左外叶切除,术后继续饲喂2-AAF20mg/(kg.day)1周,处死大鼠,获取肝脏进行HOC分离培养以及促分化,应用流式细胞仪检测卵圆细胞表面的干细胞标志c-kit、CD90及CD34,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测HOC、分化细胞、肝组织及肝外胆道的ALB mRNA和CK-19mRNA的水平,并进行统计学处理。 结果:成功建立了Lewis大鼠2-AAF/PH HOC增殖模型,分离培养HOC,并促进其分化为肝细胞和胆管上皮细胞,分离纯化的HOC流式细胞仪检测干细胞标志c-kit、CD90及CD34阳性率分别为99.8%、88.8%及3.6%,实时荧光定量RT-PCR技术检测HOC表达大量的ALB和少量的CK-19mRNA,已分化细胞ALB表达量无明显变化,CK-19 mRNA表达量明显升高。 结论:Lewis大鼠2-AAF/PH HOC增殖模型的建立是稳定可行的,通过分离和培养可以纯化HOC,具有干细胞的特征,可稳定培养和传代,诱导后可分化成肝细胞和胆管上皮细胞,在该诱导条件下主要分化为胆管上皮细胞。 第三部分:pBLAST2-hHGF质粒转染肝卵圆细胞 目的:建立pBLAST2-hHGF质粒稳定转染HOC的细胞株,观察转染细胞的生物学特性。 方法:取稳定培养的第四代雄性Lewis大鼠HOC,采用脂质体介导DNA转染的方法将pBLAST2-hHGF质粒转染到HOC,然后在倒置显微镜下观察pBLAST2-hHGF/HOC的形态变化、细胞增殖情况,检测细胞转染后的增殖分化能力,确定pBLAST2-hHGF/HOC的稳定培养条件,使用western blot方法检测pBLAST2-hHGF/HOC hHGF蛋白的表达。 结果:第四代以脂质体介导成功转染pBLAST2-hHGF质粒的HOC在培养基中添加细胞因子SCF 20 ng/ml、HGF 10 ng/ml、EGF 10 ng/ml和LIF 20 ng/ml条件下转染细胞可稳定传代14代,其形态与未转染细胞比较无明显变化,但生长增殖速度明显快于未转染细胞,去除培养液中的生长因子后pBLAST2-Hhgf/HOC迅速分化为肝细胞和胆管上皮细胞,使用western blot方法检测到转染细胞有hHGF蛋白表达,使用ELISA法检测培养液中hHGF蛋白含量高。 结论:使用脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染HOC方法可靠,转染细胞稳定培养并传代次数长于HOC,pBLAST2-Hhgf/HOC具备分泌hHGF的能力,可用于后续研究。 第四部分:受体来源pBLAST2-hHGF/HOC对大鼠移植肝的影响 目的:研究受体来源pBLAST2-hHGF/HOC在大鼠移植肝中的定位分布,pBLAST2-hHGF/HOC对受体大鼠肝功状况、急性排斥反应、免疫低反应及长期存活的影响。 方法:二袖套法建立大鼠原位肝移植模型,供体为雌性DA大鼠,受体为雌性Lewis大鼠。实验分对照组(A组)、HOC移植组(B组)、pBLAST2-hHGF/HOC移植组(C组),A组仅行原位肝移植术,B组术中供肝经门静脉和肝动脉分别注射1×10~6/mlHOC悬液各1ml,C组术中供肝经门静脉和肝动脉分别注射1×10~6/mlpBLAST2-hHGF/HOC悬液各1ml。受体大鼠均给予治疗剂量的他克莫司(0.05mg/kg,2次/天,连续8天,灌胃),术前一天开始给药,术后第8天开始每日半量减药,第13天停止给药。术后7天、14天、21天、28天、35天及42天对移植肝组织进行雄性性别决定基因Sry原位杂交染色,对移植肝组织进行免疫组化CD44、ICAM-1、Fas及CD40染色,计算各组大鼠的中位生存时间(MST),检测肝功能(ALT,DBil,GGT,ALP,XCHE,ALB)、血液细胞因子(IL-2,IL-10,IFN-γ,TNF-α,TGF-β,hHGF)、血液T细胞亚群,观察肝脏病理变化并进行急性排斥反应指数计算。 结果:A组受体大鼠术后MST明显短于B组和C组,B组大鼠术后MST短于C组;HOC和pBLAST2-hHGF/HOC主要定位分布于肝脏的汇管区周围和中央静脉周围,C组肝脏Sry阳性细胞百分率从术后7天开始持续性高于B组;A组大鼠ALT、DBil、GGT、ALP、IL-2、IFN-γ、TNF-α及CD4+/CD8+T细胞比值从术后14天开始明显高于B组和C组,B组上述指标从术后14~21天开始明显高于C组;A组大鼠ALB、XCHE、IL-10及TGF-β从术后14天开始明显低于B组和C组,B组上述指标从术后14~21天开始明显低于C组;从术后14天开始A组肝脏急性排斥反应指数明显高于B组和C组,从术后21天开始B组肝脏急性排斥反应指数高于C组:从术后14天开始A组肝组织CD44、ICAM-1、Fas及CD40免疫组化染色强度和范围大于B组和C组,从术后14~21天开始B组上述指标大于C组。 结论:受体来源pBLAST2-hHGF/HOC在移植肝内的增殖和分化能力较HOC强,主要分布在汇管区周围和中央静脉周围;受体来源pBLAST2-hHGF/HOC及其分化细胞能够在移植肝内分泌hHGF,可能通过HGF/C-Met途径对移植肝起保护作用,改善受体的肝功能;受体来源pBLAST2-hHGF/HOC在移植肝内大量增殖、分化和细胞替代后,可以有效地降低移植术后急性排斥反应指数,该方面的作用强于受体来源的HOC;受体来源pBLAST2-hHGF/HOC和HOC经门静脉和肝动脉输入移植肝后,可以有效诱导受体大鼠对移植肝的免疫低反应性,延长移植术后大鼠的生存期,pBLAST2-hHGF/HOC的作用强于HOC。


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