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应用siRNA技术抑制铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM表达的研究

郑亚婷  
【摘要】: 目的通过应用siRNA技术,对抑制铜绿假单胞菌主动外排系统外膜蛋白OprM的表达进行研究。 方法应用基因重组技术,扩增出铜绿假单胞菌oprM基因,构建铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM原核表达模型,并诱导表达标记组氨酸标签的融合蛋白OprM,切胶纯化蛋白后送生物公司免疫小鼠制备抗-OprM蛋白多克隆抗体;将针对oprM基因序列设计合成的数对siRNA分别转化入耐药铜绿假单胞菌感受态细胞中,采用抗菌素药物敏感试验,选择最佳转化浓度,拟筛选出1对针对OprM蛋白的siRNA,根据其序列构建质粒载体;将质粒载体导入铜绿假单胞菌标准菌株中,并应用Western Blot技术检测OprM蛋白量的变化,以探讨质粒载体对oprM基因的沉默效果。 结果 1.应用基因重组及纯化技术,扩增出oprM基因序列,构建OprM原核表达模型,经过诱导使组氨酸标签标记的融合蛋白OprM大量表达,并利用的Western Blot技术进行验证,最后经过切胶纯化蛋白来制备抗-OprM蛋白多克隆抗体。 2.应用经典CaCl_2方法,将耐药铜绿假单胞菌制备为感受态细胞,制备前后数据经统计学方法处理后表明,制备过程对细菌耐药性无影响。 3.化学合成3对针对oprM基因序列的siRNA,用抗菌素药物敏感试验检测导入前后耐药铜绿假单胞菌对12种抗菌素耐药性的变化,通过对转化浓度的探讨及siRNA序列的筛选,最终确定最佳转化浓度为25μl,抑制作用最明显的siRNA序列为5'-AGAUCAACGUCGCGGAGUATT-3',3'-UACUCCGCGACGUUGAUCUTT-5'。 4.Western Blot检测结果显示,导入质粒载体后PA OprM蛋白量较导入前有所减少。 结论应用筛选的siRNA序列构建的重组质粒载体,抑制了PA主动外排系统外膜蛋白OprM的表达。


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