骨髓间充质干细胞创面治疗的初步研究

【摘要】： 第一部分猪烧伤模型的建立 目的：通过动物实验,探索一种简单易行猪烧伤创面动物模型的制作方法,摸索对猪皮肤的烧伤深度、烧伤面积的控制方法,为课题的实施奠定基础,为制作猪烧伤模型提供一种新的途径和方法。 方法：3-4月龄猪2头,将其自身背部两侧对应的烧伤创面分为组织学检验组及大体观察组。猪麻醉后用电动剃毛刀将其背部皮肤毛发剃除,以俯卧位固定于手术台上,将事先准备好开窗3cm×3cm的石棉置于猪背部皮肤剃毛处,外覆有同样大小开口的铁皮,助手压紧铁皮,汽油喷灯口在距创面10cm处垂直喷烧。第一头猪按喷烧持续时间分为2秒、4秒、6秒、8秒、10秒、12秒、14秒七个创面组,每组各4个创面。烧伤后30min后观察创面皮肤变化,并于烧伤后12小时将每组的4个创面取材行组织学检查。根据第一头猪组织学检查结果,确定出浅Ⅱ度、深Ⅱ度、Ⅲ度烧伤各烧伤深度所需烧伤持续时间,第二头猪按喷烧持续时间分为2秒、6秒、14秒三个创面组,每组各4个创面,再次验证各度烧伤持续时间。烧伤后30min后观察创面皮肤改变,隔日创面换药观察创面愈合情况,并分别于1周、2周、3周、4周观察记录大体观察组创面愈合情况,烧伤后12小时将对应两侧组织学检查组的烧伤创面行交叉取材、每组各2个创面行组织学检查。 结果：烧伤后30min大体观察创面见：2秒时表皮存在、干燥、皮肤呈紫色略带白色,创面在2周内愈合；6秒时表皮存在,碳化、呈焦黄色,创面在3周内愈合；14秒时部分表皮碳化脱失,基底呈蜡白色,4周时创面仍有坏死痂皮覆盖。烧伤后12小时后病理结果示：2秒时表皮大部分细胞胞核变长,层次紊乱,生发层细胞胞核大部分排列整齐.可见表皮内液体积聚及表皮外渗出物；6秒时基底细胞胞核大部分变长,部分真皮浅层细胞胞核固缩,排列紊乱,基底层与真皮浅层间液体聚集；14秒时表皮部分脱落,真皮细胞胞核固缩,层次紊乱,皮肤附属器坏死,脂肪细胞胞核正常。而4秒时创面大体观察及病理结果接近于2秒时创面；8秒、10秒、12秒时创面大体观察及病理结果接近于6秒时创面。2秒为浅Ⅱ度；6秒-14秒为深Ⅱ度；14秒及以上为Ⅲ度。 结论：使用汽油喷灯制作猪烧伤模型方法操作简单、结果可靠、经济实惠,是一设备简单,操作便捷、安全的猪烧伤模型制作方法。 第二部分骨髓间充质干细胞创面治疗的初步研究 目的：通过动物实验,探索骨髓间充质干细胞(B-MSCs)用于烧伤创面治疗的可行性、安全性和有效性问题。摸索出使用方法、细胞数量、监测手段,为临床应用提供理论依据和实践经验,进而为临床治疗大面积Ⅲ度烧伤所致的皮肤缺损提供新的途径和方法。 方法：雄性滇南小耳猪1头,将其自身背部对应部位创面分为实验组和对照组,各两组,每组共分A.微粒皮、B.小皮片、C.大张皮、D.异体脱细胞猪皮四个创面,创面切至深筋膜浅层,面积5cm×5cm。取雌性滇南小耳猪骨髓间充质干细胞5ml放入10%α-MEM培养基,10%胎牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的无菌培养瓶中,放入95%饱和湿度,37摄氏度的CO2培养箱培养至第三代,镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测干细胞标记物CD29-抗、CD44-抗、CD45-抗及电镜检测超微结构。实验组各创面滴加骨髓间充质干细胞密度为2×106./ml,0.5ml,对照组各创面滴加等量的生理盐水。移植后创面隔日换药,并记录各组创面愈合时间及创面大体变化、于植皮后第30天后取材行HE染色组织学检查观察表皮厚度及分层及DNA比对检测。 结果：就本次实验而言(1).流式细胞仪检测发现我们培养的间充质干细胞不表达造血细胞系特有的CD45,而表达基质细胞和间质细胞特有的CD44、CD29。电镜结果显示细胞核呈椭圆形,胞质丰富,有大量微丝,单细胞核,较大,常染色体较少,异染色体较多。细胞器丰富,有微绒毛结构,核浆比较大,说明细胞蛋白合成和分泌能力旺盛,能够大量摄取营养物质,功能活跃,显示了干细胞的幼稚特性。(2)HE染色结果实验组表皮较对照组明显增厚,分层明显。(3)创面愈合时间在实验组和对照组间无明显差别,实验组创面在愈合过程中基底肉芽明显较对照组新鲜,愈合后实验组创面较对照组创面更接近于正常肤色。(4)DNA比对结果受体猪移植干细胞处皮肤未见供体猪DNA成份。 结论：(1)骨髓间充质干细胞可能通过对局部创面刺激,分泌刺激生长因子,催进局部血管化,进而改善创面基底环境,使皮片更易于成活,因而对创面修复过程可能有一定的促进作用。(2)骨髓间充质干细胞在创面修复过程中对皮肤结构调整,疤痕形成大小及厚度可能有一定影响。(3)完全依靠移植骨髓间充质干细胞于创面使其直接转化成表皮细胞进而修复创面,还难以实现。