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RNA干扰抑制survivin基因表达诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的实验研究

马静  
【摘要】: 研究背景及目的 瘢痕疙瘩是皮肤损伤如创伤、烧伤或手术后引发的纤维化病理改变,以成纤维细胞(fibroblast)的过度增生和胶原等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度沉积为特征的纤维代谢性疾病。瘢痕疙瘩的形成会破坏人的体表完美,导致功能障碍,给患者带来极大的生理和心理上的痛苦,对瘢痕疙瘩的防治一直是临床研究的重要课题。具有独特生长特性以及临床表现的瘢痕疙瘩,被众多学者视为一种创伤愈合后形成的良性肿瘤,成纤维细胞是瘢痕形成过程中的关键效应细胞。近年来研究认为成纤维细胞的异常增殖是瘢痕疙瘩发病的重要机制,其增殖与凋亡的失衡是导致瘢痕疙瘩不断增生而且难已退化的细胞学基础。而survivin基因作为迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一,和瘢痕疙瘩的形成有密切关系。研究表明:survivin基因可抑制成纤维细胞的程序化死亡,导致细胞的异常增殖和恶性转化,与瘢痕疙瘩形成密切相关。因此,抗survivin基因的治疗可能成为治疗瘢痕疙瘩的有效途径。 目前,对瘢痕疙瘩的大量研究主要集中在明确病因方面,治疗还局限在单纯的药物注射和病灶的手术切除,均无法从根本上彻底治愈,治疗后常复发,尤其瘢痕疙瘩手术后增生更明显。临床上迫切需要一种可以在瘢痕形成早期抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的方法。随着基因工程技术的出现和迅猛发展,基因治疗将成为今后治疗瘢痕疙瘩理想的治疗方法。目前,许多学者尝试应用反义寡核苷酸、核酶的方法抑制目的基因的表达,但是存在转染效率低下,作用时间短暂等缺点。随着RNA干扰(RNA interference)现象被发现,为瘢痕疙瘩的基因治疗提供了广阔的空间,RNA干扰目前已经在这一领域取得了令人瞩目的进展和成果。RNA干扰是利用与目的mRNA具有同源性的siRNA诱发序列特异性的转录后基因沉默的现象,它产生类似于“基因敲除”的生物表型,能够高效、特异地抑制靶基因,从而产生相应功能的缺失,这个过程属于转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)。RNA干扰具有特异性、高效性和持久性而得到广泛应用,目前已成功地应用RNAi技术敲除疾病相关基因,表明该技术开启了新的治疗途径的大门。RNAi目前已经在广泛的领域包括医学领域里取得了令人瞩目的进展,并广泛应用于医疗各种疾病尤其是肿瘤相关方面的治疗。虽然有整形外科学者开始应用RNAi技术特异性抑制瘢痕形成的相关因子基因的表达,但是应用体外合成siRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞survivin基因表达抑制的研究目前国内外未见相关报道。由此设想,如果瘢痕疙瘩成纤维细胞中survivin存在着高表达,并抑制了成纤维细胞的程序化死亡,那么应用RNAi技术阻止或抑制survivin基因的表达,减少survivin蛋白合成,从而抑制成纤维细胞的异常增殖和恶性转化,就有可能达到治疗瘢痕疙瘩增生的目的。因此,运用生物信息学方法,针对人survivin基因设计并合成相应siRNA分子,转染原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,下调survivin表达,抑制survivin的有效合成,观察siRNA分子对人瘢痕疙瘩成纤维细胞survivin表达和成纤维细胞功能的影响,并探讨其机制,为瘢痕疙瘩的基因治疗提供初步的理论依据。 材料和方法 1、标本 取自昆明医学院第一附属医院整形外科手术切除的瘢痕组织,所有患者均无合并皮肤疾病、结缔组织病和其他重要脏器疾病;未使用过类固醇激素、青霉胺和抗肿瘤药物;所有的标本切取前均未行放疗、激光治疗及免疫治疗;所有标本均经病理证实。采用消化法来进行成纤维细胞的原代培养。正常皮肤中均取自上述患者供皮区,为手术取皮修剪后残余皮片。 2、方法 (1)免疫组织化学染色检测survivin基因在正常皮肤组织、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中的表达,并计数瘢痕疙瘩组织的微血管密度(MVD),分析瘢痕疙瘩中survivin的表达与血管生成的关系; (2)免疫细胞化学染色检测survivin基因在瘢痕疙瘩和正常皮肤原代培养的成纤维细胞中的表达; (3) siRNA-survivin分子的设计与合成; (4)实验分组及脂质体转染siRNA-survivin分子; (5)RT-PCR法检测转染后瘢痕疙瘩成纤维细胞中survivin mRNA表达; (6)Western-blot法检测转染后瘢痕疙瘩成纤维细胞中survivin蛋白的表达; (7)流式细胞术分析细胞周期; (8)MTT法检测成纤维细胞增殖; (9)Tunel检测细胞凋亡; (10)数据处理:应用SPSS12.0进行数据统计分析,计量资料以平均数±标准差(X±S),进行T检验和方差分析,细胞生长曲线采用重复测量方差分析进行比较,P0.05为有显著性差异。 结果 1、survivin在正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表达的阳性率分别为0(0/10)、34.78%(8/23)和66.67%(20/30);瘢痕疙瘩中survivin阳性表达明显高于增生性瘢痕;瘢痕疙瘩中随survivin表达增强,MVD逐渐增高。survivin基因在瘢痕疙瘩原代培养的成纤维细胞中的表达阳性,而正常皮肤组织原代培养的成纤维细胞未见阳性表达。 2、成功构建了重组质粒pSIREN-siRNA/survivin,经基因测序显示重组质粒shRNA编码序列与我们设计的靶向survivin的核苷酸序列完全一致。 3、构建的真核表达质粒瞬时转染成纤维细胞,荧光显微镜观察转染效率达67%。RT-PCR检测成纤维细胞survivin mRNA表达,发现转染后的24h、48hsurvivin mRNA受到明显抑制,抑制率分别为52.2%和75.7%;Western-blot分析survivin蛋白表达,转染后的24h、48hsurvivin蛋白表达分别下调至54.8%和76.7%。 4、流式细胞仪检测细胞周期发现干扰质粒组S期细胞减少;G_2/M期所占比例增高,出现了G_2/M期的阻滞现象。干扰质粒组24h、48h成纤维细胞的凋亡率分别为8.8%、19.6%,显著高于阴性对照组和未处理组,随干扰时间的延长,凋亡细胞逐渐增多。 5、流式细胞仪Tunel法检测细胞凋亡:转染siRNA-survivin后,24h和48h的凋亡率分别为11.9±1.96%、21.2±2.14%,与阴性对照组(3.60±0.83%)和处理组(2.40±0.63%)相比,统计学上具有显著性差异(P0.05)。 6、MTT测定显示转染重组质粒pSIREN-siRNA/survivin后瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖受到明显抑制。 结论 1、survivin蛋白在瘢痕疙瘩组织中表达上调,并与微血管生成关系密切,提示survivin与病理性瘢痕的发生发展过程有关。 2、针对survivin基因的siRNA干扰质粒转染瘢痕疙瘩成纤维细胞后能明显抑制survivin mRNA表达,降低survivin蛋白含量,提示该基因可作为基因治疗的靶点。 3、siRNA-survivin分子对靶基因survivin抑制效果明显,抑制成纤维细胞从G_1期进入S期,而阻滞于G_2/M期,随干扰时间的延长,细胞凋亡增加。 4、siRNA-survivin转染瘢痕疙瘩成纤维细胞,生长曲线平缓,明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长。 5、本研究证实siRNA-survivin分子能够特异性抑制survivin基因表达,进而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖,诱导细胞凋亡。


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