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云南部分地区鸽粪中新型隐球菌的分离与鉴定及其血清型、配型初步研究

陶星辰  
【摘要】:研究背景:1894年新型隐球菌被确认为自然疫源性条件致病性真菌,乡下农场、蝙蝠洞、腐烂的蔬菜、瓜果、昆虫以及健康人的口腔、体表、肠道以及鸽粪等多种基质中可以检出新型隐球菌,在所有基质中鸽粪中新型隐球菌的阳性检出率和生物量都是最高的。随着化疗药物和皮质类固醇广泛应用,导管插管、腹膜透析、器官移植等大量开展,特别是近年来人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人数的增多,真菌感染成为社会关注焦点。其中新型隐球菌的感染尤为突出,主要侵犯人类中枢神经系统和呼吸系统,导致致命性的脑膜脑炎和呼吸系统疾病,如今已引起国内外学者的广泛关注。隐球菌病死亡率高,但目前隐球菌病系统流行病学资料尚缺乏,人类之间相互传染的病例极其罕见,而隐球菌普遍存在于自然环境中,对新型隐球菌的生存环境的研究已学成为焦点。在我国,新型隐球菌临床株是研究重点,对新型隐球菌环境株的调查研究较少。2013年林丽娜等在大陆15个地域检出80株新型隐球菌环境株,而且发现隐球菌临床株与环境株之间在中国大陆范围内具有较高的同源性,因此为了能够有效避免新型隐球菌的感染,易感人群不能与滋生新型隐球菌的环境接触。研究目的:目前云南省不同地理环境新型隐球菌的分布未作系统调查研究,鸽粪是新型隐球菌滋生的环境之一,本研究拟对云南省部分地区鸽粪中的新型隐球菌进行分离鉴定,并调查其带菌率以及分析其表型特征,为隐球菌病的预防、诊疗及科研提供参考依据。研究方法:1.研究对象:本次研究采用黑米琼脂培养基对来自云南省大理、昭通、曲靖、临沧地区的473份鸽粪标本培养、纯化分离,共分离鉴定出152株新型隐球菌。2.实验方法:2.1两种新型隐球菌选择性培养基的比较研究:采用黑米琼脂培养基(Black Rice Agar Medium)和咖啡酸玉米琼脂培养基(Caffeic Acid Cornmeal Agar Medium,CACA)对鸽粪中新型隐球菌进行分离,对两种选择性培养基分离、纯化和培养效果进行比较。2.2云南省部分地区鸽粪中新型隐球菌的分离与鉴定:采用黑米琼脂培养基对云南省大理、昭通、曲靖、临沧地区的473份鸽粪标本进行分离纯化和培养,并且通过新型隐球菌特异性引物CN4和CN5进行PCR扩增,根据扩增产物大小对其进行鉴定,并比较各个地区鸽粪中新型隐球菌带菌率的异同。分离获得新型隐球菌菌株并进行保存。2.3云南部分地区鸽粪中新型隐球菌血清型与配型分析:采用新型隐球菌血清型及配型的特异性引物,对分离自鸽粪的152株新型隐球菌进行聚合酶链反应(Polimerse Chain Reaction,PCR)扩增,根据阳性或阴性的扩增结果对新型隐球菌的血清型和配型进行鉴定。结果:1.黑米琼脂培养基中新型隐球菌菌落光滑湿润,呈棕黄色,状似熔化巧克力。通过黑米琼脂培养基处理鸽粪样本70份,共分离鉴定出新型隐球菌菌株23株,检出率达为32.86%。咖啡酸玉米琼脂培养基(Caffeic Acid Cornmeal Agar Medium,CACA)中新型隐球菌菌落较黑米琼脂培养基(Black Rice Agar Medium)上的菌落小,褐色且干燥。咖啡酸玉米琼脂培养基(Caffeic Acid Cornmeal Agar Medium,CACA)中共分离鉴定出11株新型隐球菌,检出率为15.71%。黑米琼脂培养基的检出率与CACA培养基的检出率比较差异有统计学意义(P0.05),且白色丝状真菌覆盖性生长的培养皿数目少于CACA培养基,污染程度低于CACA培养基。2.云南省4个地区473份鸽粪标本中共分离鉴定出152株新型隐球菌,平均阳性检出率为32.13%。其中大理地区检出率为26.08%,昭通地区检出率为30.05%,曲靖地区检出率为81.81%,临沧地区检出率为37.03%。4个地区检出率差异有统计学意义(χ2=41.87,P0.01)。3.云南4个地区新型隐球菌环境株血清型均为A型,交配型均为α型。结论:1.作为新型隐球菌的选择性培养基,黑米琼脂培养基的分离、纯化与培养效果(检出效果和检出率)均优于CACA培养基。2.云南部分地区鸽粪中新型隐球菌带菌率较高,且不同地区带菌率不同。3.云南4个地区新型隐球菌环境株血清型均为A型,交配型均为α型,与临床分离菌株具有高度同源性。


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