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藏药“蒂达”几种原植物化学综合评价、DNA条形码识别系统构建及其利胆有效性评价

杨晓泉  
【摘要】:【目的】通过HPLC-DAD多谱功能,建立多波长同时检测青叶胆中7种有效成分含量的HPLC方法;优化检测时青叶胆中7种有效成分提取的最佳工艺。比较11种藏药“蒂达”基原植物中7种有效成分的含量,并进行整合评控,为资源利用提供依据。采用一测多评法测定獐牙菜属植物中的4种环烯醚萜类,考察化合物之间采用相对校正因子进行含量测定的准确性和可行性。对14种藏药“蒂达”基原植物进行多物种的生物遗传和亲缘关系的比较研究,构建基于ITS片段的DNA条形码识别系统。比较藏药“蒂达”四种药用植物(青叶胆、川西獐牙菜、印度獐牙菜、唐古特虎耳草)的利胆作用。【方法】采用HPLC-DAD扫描3D图谱,直接获得各环烯醚萜类、各酮及齐墩果酸的最适宜吸收波长。根据结果开启210 nm、240 nm和265 nm多波长采集数据同时检测7种有效成分;采用L9(34)正交试验,以7种有效成分含量为指标,考察提取溶剂的单次液料比、单次提取时间、提取温度、提取次数等因素的影响,优化超声提取工艺。对11种藏药“蒂达”基原植物中7种有效成分含量的结果进行归一化与三维数据集成化。以獐牙菜属植物为研究对象,采用HPLC测定4种活性环烯醚萜苷之间的相对矫正因子,并分别以这4种成分的任意一种作为参照成分,建立可对另外3种成分检测的“一测多评方法”。采用建立的一测多评法测定并计算不同种獐牙菜属植物中4种成分含量,并与外标法比较,以评价一测多评法的准确性。利用DNA条形码方法,提取14种植物组织DNA,通过PCR扩增和测序获取ITS序列信息,采用MEGA 6.06(Molecular evolutionary genetics analysis)计算K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,并构建邻接NJ(Neighbor-Joining)系统发育树。取雄性SD大鼠100只,体重(260±20)g,随机分为10组,各组分别为正常组(生理盐水组)、蒂达高低剂量(1.5,0.75 g/kg)组、阳性组熊去氧胆酸片0.05 g/kg组。以上各组分别给予各受试物,1次/d,连续7 d,采用大鼠胆总管插管实验,通过胆汁流量、胆汁成分分析观察受试药的利胆作用。【结果】7种成分在线性范围内线性关系良好,相关系数r均达到0.999 9,平均回收率98%~102%,RSD均小于3%;最佳提取工艺单次液料比为10,每次提取30 min,提取温度为50℃,提取次数为3次。在一定线性范围内,RCF值稳定;且不同实验条件下,重现性良好;不同种獐牙菜属植物中4种环烯醚萜类成分计算值与实测值无明显差异。ITS序列变异位点丰富、鉴别能力高、序列长度适宜。藏药“蒂达”能促进大鼠胆汁流量的分泌,同时降低大鼠胆汁中总胆固醇、总胆色素的含量,增加胆汁酸的含量。【结论】HPLC-DAD多波长多通道检测青叶胆质量具有简便、高效、重复性好等特点;该提取工艺操作简单、合理、可行。藏药“蒂达”基原植物中绝大多数含有这7种有效成分,但种间差异较大,通过化学品质综合指数进行整合评控对质量控制有参考价值。一测多评方法准确可行,为一测多评法用于中药质量控制提供了可靠依据。建立基于ITS序列的DNA条形码识别系统,可准确鉴定多基原藏药“蒂达”物种。藏药“蒂达”4种原植物均有一定的利胆作用。本工作为藏药“蒂达”基原植物鉴定,药物分析与质量控制、药效学等同性差异性、分子生药学研究等提供基础资料,并为多基原药用植物鉴定研究提供借鉴和参考。


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