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内切木聚糖酶和木糖苷酶的耐盐性改性研究

刘钰  
【摘要】:内切木聚糖酶和β-木糖苷酶都是非常重要的糖苷水解酶,它们在食品、饲料、造纸、纺织、能源等方面都具有重要的应用价值。耐盐酶在高盐浓度下仍然有催化活性和稳定性,可应用于高盐食品加工、海产品加工、洗涤及其它高盐环境生物技术领域;同时高盐环境可以防止微生物的污染,从而节省灭菌等所消耗的能源。通过基因工程手段,可对酶进行耐热、耐酸、耐碱等性质改性,从而使酶具有更优良的性质,但耐盐性改性还鲜有报导。本文对糖苷水解酶第10家族内切木聚糖酶和第43家族木糖苷酶进行耐盐性改性研究,结果如下:1内切木聚糖酶的耐盐性改性以实验室提供的内切木聚糖酶基因家族重排突变子s42f11和s45f07为材料,分析其酶学性质发现:两种突变子均为高温酶,最适温度为80oC,较野生型XynAGN16L(50oC)、XynAHJ3(70oC)更具有高温活性;在含有20%(w/v)NaCl的反应体系中,突变子s42f11和s45f07较野生型XynAHJ3和XynAGN16L的酶活分别提高46%和15%;在含20%(w/v)Na2SO4反应体系中,突变子s42f11和s45f07较野生型分别提高10%和20%;在剩余四种盐离子中{KCl、KNO3、NaNO3、(NH4)2SO4},突变子较野生型酶学性质变化不明显。2木糖苷酶HJ14GH43的耐盐性改性以实验室提供的木糖苷酶基因HJ14GH43为素材,利用同源序列多序列比对分析以及基因定点突变原理,将第322号位点缬氨酸突变为天冬氨酸,从而获得突变体HJ14GH43 V322D,并成功在大肠杆菌中获得异源表达,分析其酶学性质发现:突变子HJ14GH43 V322D最适反应温度为25oC,在20oC处理1 h,酶活仍保留70%以上;在含有20%(w/v)NaCl、NaNO3、(NH4)2SO4反应体系中,突变子HJ14GH43 V322D较野生型HJ14GH43的盐抗性均提高20%;在含有20%NaCl、Na2SO4、(NH4)2SO4溶液中孵育1 h后,突变子较野生型盐稳定性提高1-2倍,在剩余的KCl、KNO3两种盐离子中突变子较野生型酶活性变化不明显。总结:本研究通过分子技术手段获得2个新型内切木聚糖酶突变子S42f11和s45f07,对其基本酶学性质以及6种盐抗性、稳定性进行了研究;同时通过定点突变手段获得了1个耐盐的木糖苷酶突变子HJ14GH43 V322D,对其进行了耐盐性等酶学性质研究。该研究为后期耐盐木聚糖酶的应用及耐盐机理研究奠定了基础。


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