miR-5002-5p响应叶酸缺乏并通过靶向调控Gadd45α影响HCT-116细胞迁移能力的研究

【摘要】：叶酸(folate)隶属于B族维生素,是一碳代谢的关键组分。叶酸与DNA甲基化、DNA合成的保真性及损伤修复息息相关。叶酸缺乏对上述DNA正常代谢活动具有胁迫作用,从而提高多种遗传-环境相关疾病的风险,包括肿瘤的发生发展。Gadd45α是一种DNA损伤修复和细胞生长阻滞蛋白,在特定环境胁迫和DNA损伤后表达量可显著增加,并诱发细胞周期阻滞和凋亡。前期研究提示miRNAs可响应叶酸缺乏并调控靶基因的表达,影响一系列生物学过程。本文围绕(1)叶酸缺乏下人结直肠癌细胞株HCT-116迁移能力和Gadd45α表达的改变;(2)miR-5002-5p对Gadd45α的靶向调控及其介导的细胞迁移能力的变化开展研究。旨在为特定miRNA响应叶酸缺乏后对靶基因表达及相关生物学过程的影响提供进一步的科学证据。依据本实验室对基因组稳定性维护的叶酸浓度界定,以氧化型叶酸(folic acid,FA)缺乏浓度(22.6 nmol/L)和充足浓度(2260 nmol/L)分别干预培养HCT-116细胞;根据FA缺乏对Gadd45α表达影响以及分别转染特异小干扰RNA(siGadd45α)和miR-5002-5p模拟物后该基因表达改变的最佳时效,将培养干预时间分别设为7天和60 h。运用Poly(A)加尾法RT-qPCR检测FA缺乏时miR-5002-5p转录水平改变、双荧光素酶报告基因检测系统验证受试细胞miR-5002-5p与Gadd45α之间的靶向性;RT-qPCR和Western Blot分别在转录和翻译水平分析FA缺乏时受试细胞Gadd45α表达改变;在同等干预条件下探讨siGadd45α和miR-5002-5p模拟物分别转染HCT-116细胞后对Gadd45α表达的影响,以确认Gadd45α的表达改变和miR-5002-5p与其靶向关系;以Transwell实验和划痕实验评价不同FA浓度、以及在FA缺乏下转染miR-5002-5p模拟物对HCT-116细胞迁移能力的影响。实验结果显示:(1)FA缺乏7天和60 h均上调Gadd45α表达(P0.05)、细胞迁移能力下降(P0.01);FA缺乏时,siGadd45α恢复细胞迁移能力,提示FA缺乏可通过上调Gadd45α表达抑制受试肿瘤细胞的迁移。(2)miR-5002-5p直接靶向Gadd45α,前者表达在FA缺乏60 h后出现下调(P0.01);过表达miR-5002-5p可阻断FA缺乏对Gadd45α表达的上调作用(P0.01),提示Gadd45α通过miR-5002-5p的靶向调控以响应FA缺乏。(3)FA缺乏时,转染miR-5002-5p模拟物可促进细胞迁移(P0.05),提示上调miR-5002-5p表达可以逆转FA缺乏对受试肿瘤细胞迁移能力的抑制作用。综上所述,FA缺乏通过抑制受试细胞HCT-116中miR-5002-5p表达,使其靶向的Gadd45α表达上调,进而抑制细胞迁移。该研究首次验证了miR-5002-5p对Gadd45α的靶向关系,初步提出FA缺乏可在离体情况下,抑制结直肠癌细胞miR-5002-5p表达、释放Gadd45α表达、削弱肿瘤细胞迁移的可能机制和路线,为有效抑制肿瘤细胞的转移提供了新的思考。