牦牛奶渣酪蛋白源α葡萄糖苷酶抑制肽的制备工艺与稳定性研究

【摘要】：本实验以牦牛乳奶渣酪蛋白为研究对象,探究食源性牦牛乳奶渣酪蛋白的-葡糖苷酶抑制活性的优化工艺。采用生物信息学在线软件NCBI蛋白数据库对牦牛乳、水牛、黄牛的氨基酸序列进行比对分析。经Peptide Cutter模拟酶切软件对牦牛乳酪蛋白氨基酸序列进行模拟酶切,通过两步酶解单因素实验和响应面优化酶解工艺筛选最佳酶解条件。最后采用液质联用(LC-MS/MS)进行氨基酸序列鉴定。与文献检索的-葡萄糖苷酶氨基酸序列进行比对。通过pH值在不同温度时间下对-葡萄糖苷酶抑制活性的影响,制备具有-葡萄糖甘酶抑制活性的酪蛋白肽果味饮料。(1)首先利用在线蛋白数据库NCBI,查询牦牛、水牛、黄牛乳酪蛋白和乳清蛋白的氨基酸序列并进行比对分析。牦牛乳与其他两种乳蛋白的组成差异,对三种不同乳的酪蛋白和乳清蛋白含量、氨基酸残基数、分子量、相似度、疏水性氨基酸残基进行差异分析。牦牛乳酪蛋白与水牛、黄牛相比,疏水性氨基酸残基比例相差不大。其中牦牛乳-乳白蛋白和-乳球蛋白高于水牛和黄牛乳。(2)采用Peptide Cutte模拟酶切软件对牦牛乳酪蛋白的氨基酸序列进行模拟酶切,得到胃蛋白酶和胰蛋白酶为最适蛋白酶。以肽含量和-葡萄糖苷酶抑制率为指标,选择了五种蛋白酶,胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶在真实酶解最适条件下进行验证。发现胃蛋白酶酶解产物的-葡萄糖苷酶抑制率最高为36.76%。其次为胰蛋白酶的-葡萄糖苷酶抑制率高为15.19%。与模拟酶切预测结果一致。(3)通过单因素实验和响应面优化实验进行了两步酶解法制备-葡萄糖苷酶抑肽的工艺优化。确定最佳酶解工艺为:胃蛋白酶酶解时间150 min、胰蛋白酶酶解时间240 min、胃蛋白酶加酶量300 U/g、胰蛋白酶加700 U/g,在此条件下得到的酶解肽的-葡萄糖苷酶抑制率为72%。通过质谱鉴定对酪蛋白肽酶解液进行了质鉴定,得到51条氨基酸序列,与文献检索到的-葡萄糖苷酶抑制序列进行比对发现了16条具有-葡萄糖苷酶抑制活性的序列,包括LT、RL、PL、PI、PQ、EV、LG、LL、TT、AKQ、ID、EL、VL、HKEMPFPK、PFP、GD。(4)研究pH、温度、常见食品辅料对牦牛乳酪蛋白酶解肽活性的影响,结果发现:在酸性条件下,pH4下所制备水解肽的α-葡萄糖苷酶抑制率最高,为3.23%。在90℃下灭10 min,所制备酶解肽的-葡萄糖苷酶抑制活性没有明显损失,抑制率高达98.26%。AK糖、木糖醇、柠檬酸等常用辅料的添加对所制备酶解解肽的-葡萄糖苷酶抑制活性没有显著影响(P0.05)。在此基础上,制备了一种具有降血糖活性的酪蛋白肽果味饮料,其最佳配方为:酪蛋白水解液25%、浓苹果汁7%、柠檬酸0.05%、柠檬酸钠0.02%、木糖醇2.2%、维生素C0.01%、苹果香精0.01%、乙基麦芽酚0.0075%、AK糖0.0225%甜蜜素0.01%。