铜绿假单胞菌中影响RsmA调节基因的筛选及调节途径研究

【摘要】：铜绿假单胞菌(Dseudomonas aeruginosa)是临床上重要的革兰氏阴性条件致病菌。该菌分布广泛,可导致人体不同组织的感染。铜绿假单胞菌是导致医院内感染的主要病原菌之一,并且对多种抗生素具有很高的抗性,难以治疗[Pier.2002]。 RsmA是铜绿假单胞菌的一种RNA结合蛋白,可以结合rnRNA前导序列,从而阻碍转录起始位点与核糖体的结合,实现转录后调节。RsmA、RsmY和RsmZ组成Rsm调节系统,该系统又与铜绿假单胞菌的双组分系统相互作用,依赖于GacS/GacA系统并受RetS和LadS的调节。RsmA作为N-乙酰高丝氨酸内酯的负调节因子,可对群体感应(Quorum sensing)系统进行调节,还负调节抗生素抗性、N-乙酰高丝氨酸及胞外酶的合成；正调节细菌丛动、菌喹诺酮信号分子的合成。此外,还影响Ⅲ型分泌系统,胞外产物(如绿脓菌素、氰化氢、IL-凝集素)的形成,毒性相关基因的表达。临床研究表明,RsmA缺失的铜绿假单胞菌其致病能力也发生了明显的变化。 尽管人们对RsmA在转录和翻译水平上的调节作用做了大量研究,但其具体调控机制并不是很清楚。本研究在全基因组水平上,采用转座突变的方法,筛选了那些对rsmA具有调节作用的基因,并对其中一些重要基因进行了深入研究。 本研究将目的基因rsmA启动子经PCR扩增,克隆到缺失启动子并含有报道子luxCDABE荧光素酶的pMS402质粒载体上,连接到含有整合位点的CTX6.1质粒,可利用噬菌体结合位点进行位点专一性重组,将rsmA-LuxCDABE整合到铜绿假单胞菌的基因组上,得到构建菌株PAO1(CTX-rsmA),具有比质粒更稳定的遗传复制,发光值直接反应rsmA基因的表达情况。实验利用转座子pBT20随机插入受体菌染色体上的原理,对PAO12(CTX-rsmA)进行随机转座突变,筛选到9株影响,smA表达的突变体。通过对这9株突变体进行随机PCR,确定突变体中转座子在染色体上插入的具体位点,从而确定调节基因。再根据生物信息分析和实验结果,推测这些调节基因的功能。同时对这9株转座突变体进行了一系列的表型测定,如生物膜、绿脓菌素、刚果红试验、运动性试验、抗生素敏感性试验,研究了这些基因的生物学功能。选取对刚果红、运动性、抗生素敏感性等都发生明显变化的突变菌株A7,对其进行了互补试验。深入研究表明,A7转座突变体中被破坏的基因为pgi(PA4732),它编码6-磷酸葡萄糖异构酶,在铜绿假单胞菌碳源代谢中发挥作用,将pgi基因敲除,得到了Δpgi。这一敲除突变体与转座突变株A7表型一致,研究结果将rsmA基因同碳源代谢系统相联系。这些结果为了解铜绿假单胞菌致病因子的调节机理提供了新的数据和线索。