没食子酸冰片酯在肝微粒体中的代谢研究

【摘要】：一个新药在上市之前的临床前代谢研究是新药进行临床实验的必要过程。药物的体外代谢对阐明代谢产物的结构、确定参与药物代谢的酶系、评价药物的相互作用,最终判断药物的安全性有着重要的意义。没食子酸冰片酯(MBZ)作为候选心血管药物,已在本实验室初步进行了药动学和药效学以及毒理学的研究,其结果均显示出了其对心血管作用方面的独特优势。本实验主要是在MBZ已有的基础研究之上阐明了MBZ的作用机制,与其他药物的相互作用,为合理安全用药提供了理论基础。作者的具体贡献是： 1.建立鼠肝微粒体和人肝微粒体制备以及检测方法,为进一步体外代谢实验提供了可行有效的模型。采用差速离心法成功制备出了鼠肝微粒体和人肝微粒体,并通过Bradford法测定鼠肝微粒体和人肝微粒体中蛋白的含量,结果表明鼠肝微粒体的蛋白含量为14.58±0.55 mg/mL,人肝微粒体的蛋白含量为20.09±0.24 mg/mL。采用荧光底物法测定了微粒体的活性,实验结果表明鼠肝微粒体和人肝微粒体,当蛋白浓度在0.125mg/ml到1.5 mg/ml间,反应时间60 min之内,微粒体均有活性。 2.在建立的鼠肝和人肝微粒体体外代谢模型的基础上,初步进行了MBZ在肝微粒体中的代谢实验,并且建立了采用HPLC对MBZ进行定量检测的方法。该方法的方法学考察结果显示,MBZ在0.125μL-50μL内具有较好的线性关系,高、中、低三个浓度的回收率均在90%以上,精密度、稳定性实验结果的RSD均小于5%。利用建立好的HPLC方法分别对MBZ在鼠肝微粒体和人肝微粒体中的代谢产物进行酶促反应动力学分析,计算出了鼠肝微粒体中的代谢产物M1’、M2’、M3’的酶促反应动力学参数,分别是,M1’的Vmax值为52.87±1.24 AUC/min/nmol,Km值为26.99±1.02μM,CLint为1.95±0.06；M2’的Vmax值为23.84±0.87 AUC/min/nmol,Km值为18.82±0.67μM,CLint为1.26±0.03；M3’的Vmax为114.81±1.56 AUC/min/nmol,Km值为16.87±0.36μM,CLint为6.82±0.07。同时计算出了人肝微粒体中的代谢产物M1、M2、M3的酶促反应动力学参数分别是,M1的Vmax值为3.927±0.014 AUC/min/nmol,Km值为23.634±0.05μM,CLint为0.166±0.002；M2的Vmax值为1.092±0.006AUC/min/nmol,Km值为7.965±0.011μM,CLint为0.137±0.004；M3的Vmax为4.486±0.005 AUC/min/nmol, Km值为28.839±0.03μM,CLint为0.156±0.001。 3.确定了在人肝微粒体中参与MBZ代谢的CYP450酶系。利用特异性抑制剂法确定了参与MBZ代谢的酶系为CYP2C8,分析讨论了MBZ的合理安全用药情况。 4.初步鉴定了MBZ在鼠肝微粒体中的代谢产物。采用HPLC-MSn法对代谢产物的结构做了初步的定性分析,分析结果表明,MBZ的三个代谢产物M1’、M2’、M3’的分子量均为322.3,系MBZ单加氧生物转化得到。通过二级质谱图分析三个产物的结构相类似。