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转褪黑素合成酶基因林烟草的产生及其抗逆性和外源褪黑素对离体植物生长的影响

张来军  
【摘要】:褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine;Melatonin;MEL)是由松果腺合成的一种广泛存在于动物界的激素,具有调节昼夜节律,促进睡眠,抗氧化、清除自由基等作用。自从1995年首次发现褪黑素存在于植物中后,褪黑素在植物中是否普遍存在及其在植物中的功能引起了广泛关注。相关的报道主要着眼于测定植物及植物不同器官中褪黑素的含量及其变化。已经发现在所检测的100多种植物中普遍含有不同水平的褪黑素。近年来植物褪黑素的功能研究,多着重于研究外源褪黑素对植物生长、形态发生以及对某些环境胁迫的影响。这些研究对于阐明植物褪黑素的功能还是初步的。通过褪黑素合成酶基因转化,有可能提高植物内源褪黑素含量。进而与野生型作比较,有可能进一步研究植物褪黑素的功能。同时,利用离体培养体系研究外源褪黑素对植物生长影响和对胁迫环境的抗性将为阐明褪黑素生理功能提供更多的科学证据。 本研究通过农杆菌介导的转化技术,将褪黑素生物合成途径中的两个关键酶芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase, AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase, HIOMT)基因,导入林烟草(Nicotiana sylvestris),获得了转基因植株,测定了转基因植物中褪黑素含量,以及UV-B辐射对转基因植物的影响。并研究了外源褪黑素对几种药用植物生长和对盐胁迫及UV-B辐射的影响。所取得的主要研究结果如下: 1.以林烟草叶片为材料,通过农杆菌介导法,将褪黑素生物合成酶AANAT与HIOMT基因转入林烟草,获得了转基因再生植株。经PCR、RT-PCR、real-time PCR和1FISH鉴定,证明AANAT和HIOMT基因已经整合到林烟草植物基因组中,并在转录水平上表达。农杆菌浸染浓度、时间对转化频率有明显影响。农杆菌菌液在OD600=0.5条件下对预培养2-3d的外植体感染10-15min,而后在附加120mg/L的庆大霉素(gen)MS选择培养基上培养,获得了林烟草阳性转基因再生植株。 2.通过RP-HPLC法测定转基因林烟草不同株系及其亲本(未转基因株系)的褪黑素含量,发现pYXU55质粒(含gen抗性标记和AANAT-HIOMT基因)的转基因株系的褪黑素含量均高于pZP122质粒(仅含庆大霉素抗性标记,不含AANAT-HIOMT基因的空白质粒)的转基因株系和对照株系。在提取植物褪黑素过程中,用固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)小杞对样品进行了纯化和富集,有效避免了分离差、峰形不良等现象,使样品得到了较好的色谱分离效果。 3.对彗星电泳方法进行了优化,简化了传统的“三明治”胶版制备方法。将“扩展片”引用于胶版制备中,使用“扩展片”将细胞和低熔点胶混合液扩展开,使每张载玻片上的样品数由以前的1个增加至5-7个,铺胶速度快,不脱胶,胶层薄,提高了实验效率 用改良后的彗星电泳程序分析比较了转基因林烟草及对照植株叶肉原生质体对UV-B辐射损伤的效应,发现0.5 W·m-a辐射强度下,在0s-10s的时间内,代表DNA损伤程度的TailDNA%值在转基因植株中总是低于相同辐射剂量下的非转基因对照株,且转基因林烟草原生质体所耐受的UV-B辐射剂量最高达到30s,而非转基因林烟草所能耐受的辐射剂量为10s。反映出AANAT-HIOMT基因在转基因株系中的表达减缓了细胞对UV-B辐射引起的DNA损伤。 4.比较了盐(NaCl浓度为0、50、100、200mM)胁迫条件下转基因和野生型林烟草悬浮培养细胞成活和死亡率,证明转基因系细胞显示较高的耐盐性。100mM的NaCl溶液使两种类型细胞的凋亡率均达到最高值,野生型(对照组)悬浮细胞的凋亡率为87.5%,转基因林烟草细胞凋亡率为63.3%,而所有盐浓度下的转基因细胞的死亡率总是低于对照。 5.研究了外源褪黑素对离体培养的几种药用植物生长和抗逆境胁迫的影响。 (1)以浓度为0,3μM,6μM,12μM和24μM的褪黑素处理离体培养的虎杖(Polygonum cuspidatum)茎段,发现培养基中添加低浓度的褪黑素(3μM,6μM)对虎杖茎段生根和苗的生长有明显的促进作用,浓度为6μmM时,促进虎杖生长的效果最为显著,苗高达到(7.63±1.45)cm,叶面积为(31.8±6.55)cm2,平均根数为(2.44±1.42)个,根长度为(2.79±1.20)cm。而对照组的苗高为(4.07±2.19)cm,叶面积为(18.99±6.88)cm2,平均根数为(1.67±1.53)个,根长度为(2.66±1.58)cm。然而高浓度(24μM)则对苗的生长有抑制作用。褪黑素的促进生长作用类似于IAA。 (2)培养基中添加外源褪黑素对滇黄芩(Scutellaria amoena)愈伤组织生长有明显影响。培养基上附加的褪黑素浓度为0时,愈伤组织增长率为84%,不定芽分化率为5.63%,低浓度的褪黑素(0.1μM,1.0μM,10.0μM)促进愈伤组织的增殖和不定芽分化,附加0.1gM褪黑素时,愈伤组织的增长率最高,达到171%。1.0μM的褪黑素作用下得到最高分化率,为30.4%。而高浓度(100.0μM)时,则对愈伤组织的增殖和不定芽分化有抑制作用。 (3)应用彗星电泳技术研究了外源褪黑素对大叶秦艽(Gentiana macrophylla)愈伤组织原生质体在UV-B辐射下DNA损伤的影响。UV-B辐射强度为0.5 W·m-2时,在0s-30s的时间范围内,代表DNA损伤程度的TailDNA%值在褪黑素处理的组中总是低于相同辐射剂量下的对照组。而且对同一剂量(40s)UV-B辐射后的培养不同时间的原生质体测定发现,外源褪黑素处理组TailDNA%值低于相同培养时间下未用褪黑素处理的组,表明外源褪黑素提高了UV-B辐射引起的细胞DNA损伤修复能力,降低DNA损伤的程度。这种修复效应与外源褪黑素浓度密切相关,高浓度褪黑素(10.0μM)明显优于低浓度褪黑(1.0μM)


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