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禽流感病毒神经氨酸酶的分离纯化及其糖链谱研究

马恬然  
【摘要】:背景及意义:流感病毒神经氨酸酶(也称唾液酸酶,NA):是位于流感病毒囊膜表面的一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,具外切糖苷酶活性,其作用是水解切除细胞表面甚至病毒自身糖蛋白糖链末端的唾液酸分子,以利于子代病毒的释放。NA的糖基化可以保护NA蛋白避免宿主蛋白酶的攻击,从而扩大病毒宿主范围、增加病毒毒力。此外,糖基化的发生与变化对NA水解释放唾液酸的能力亦有影响。现在关于NA糖基化的研究较少,且一般集中在其糖基化位点研究,对NA糖链谱及糖链结构的研究目前国内外仍是空白。本实验讨论了禽流感病毒NA上糖链与其亚型、源性及致病性之间的关系,为禽流感的快速分型及监测预警提供实验依据;同时,绘制了NA的糖链结构图谱,以期为禽流感的治疗提供新的结构基础和潜在药物靶点。 实验及结果:本实验第一部分中将NA特异的竞争性抑制剂4-氨基苯草氨酸作为亲和配体,固定于环氧化磁性微粒表面,制备成对NA具有特异亲和力的功能化磁性微粒,建立基于此种磁粒分离纯化流感病毒NA的方法,优化提取条件(磁粒用量,结合时间,洗脱时间)并进行特异性验证。经SDS-PAGE以及MALDI-TOF-MS技术鉴定,提取蛋白分子量与文献报道一致。最后应用该方法对实验室现有8种毒株的NA进行分离纯化,为本实验后续研究提供材料。本实验为流感病毒NA的分离纯化提供了一种行之有效的手段,该方法操作简便快捷、特异性高,对NA有着良好的提纯效果,还可扩展应用于其他复杂样本中NA的提取。 本实验第二部分对经纯化的8种病毒NA荧光标记后,应用凝集素芯片技术进行检测,在糖蛋白水平上得出各毒株NA上糖链的凝集素识别谱,由此对应获得其糖链谱的部分糖型信息,并通过数据分析及差异比对,发现NA糖链类型与病毒源性、NA亚型以及致病性之间均存在一定程度的关联:(1)病毒源性与NA糖链类型之间的关系:以两种高致病性H5N1流感病毒为例,其NA亚型与致病性均相同,源性上的差异表现为:凝集素PHA-E和Con A识别的糖链结构在鸡源毒株中相对高表达,LEL、RCA-120及SBA识别的糖链结构在鸭源毒株中相对高表达;(2)在不同NA亚型N1型与N2型的比较中发现:无论是在鸡源还是鸭源毒株中,N1型的NA表面,凝集素LCA识别的糖链结构均相对高表达,而在N2型的NA上ACA识别的糖链结构均相对高表达;(3)致病性与NA糖链类型之间的关系:将8种病毒按致病性高低分为两组,虽每组的4种病毒其源性、NA亚型不尽相同,但其NA的糖链类型仍表现出一定的规律性:凝集素ECA识别的糖链结构在且仅在4种高致病性毒株中被发现;ACA识别的糖链结构的表达量在低致病性毒株中远高于高致病性毒株。 本实验第三部分借助滤膜和PNGase F酶,同时实现NA中N-糖链的释放、糖链与蛋白的分离的双重目的,经亲水柱Sepharose4B纯化后,获取实验室现有8种毒株NA的全部糖链,利用MALDI-TOF/TOF-MS技术获得其“糖链指纹图谱”,并结合数据库信息对糖链结构进行解析,绘制出8种病毒NA的糖链结构图谱。从图谱上可以看出,各毒株NA的糖链峰出峰位置相似,相对强度却表现出明显差异,其中有12个糖链峰共同存在。将每种病毒NA的所有糖链峰对应的糖链结构进行归类,各毒株分别含有5-7种糖链类型不等。注释结果显示NA的糖链结构具有微不均一性,可能存在不含有五糖核心结构的直线型糖链结构。且在各种来源的病毒NA中,均出现数据库中注释其来源为鸡源的糖链,这与病毒均由鸡胚增殖有关。


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