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红车轴草异黄酮提取、分离纯化及其抗氧化活性的研究

王晓燕  
【摘要】:红车轴草(Trifolium pratense L.)作为一种新型的中药被引入中国,含有多种异黄酮,它们主要以苷的形式在植物体内存在。据文献报道,红车轴中的异黄酮可以抗肿瘤,并且对更年期综合症、骨质疏松、胃溃疡等疾病有治疗和改善的作用。 该研究采用实验室多年对天然药用植物的研究方法,对红车轴草中总异黄酮进行提取、分离、纯化、精制以及对其抗氧化活性进行研究。该实验主要研究结果: 1、参考已有文献中对异黄酮的提取方法,根据异黄酮本身的结构性质以及结合工业生产,本文对红车轴草异黄酮的提取工艺进行了优化,确定了最佳提取方案:超声辅助pHH13水提,料液比1:25(m/V),提取时间为40min,提取2次,提取率可达到1.31%,纯度达10.32%。同时对红车轴草不同部位(叶、花)总异黄酮含量进行测定,发现不同部位异黄酮含量有所差异。 2、通过对多种大孔吸附树脂进行筛选,选用D101树脂作为分离载体,洗脱体系为乙醇,从上样液pH、洗脱剂浓度等各方面进行考察,对红车轴中异黄酮进行初步的分离纯化。确定最优纯化方法:上柱以后分别用2BV蒸馏水,2BV35%乙醇洗脱,5BV80%乙醇洗脱,将80%乙醇洗脱液收集合并,浓缩到小体积,备用。经过大孔树脂富集纯化后的红车轴草总异黄酮的纯度达到20.35%,收率69.83%。 3、同时结合氧化铝静态吸附法与乙酸乙酯回流法分别对D101大孔吸附树脂富集纯化后的红车轴异黄酮进行二次纯化,以期达到更高的纯度。结果显示经过A1203静态吸附和乙酸乙酯回流纯化后,红车轴草总异黄酮纯度分别达到52.16%、60.64%,收率分别为30.66%、74.8%。 再通过硅胶柱层析对乙酸乙酯回流后的异黄酮进行处理,以期得到异黄酮单体,并达到进一步纯化的效果。结果显示,通过硅胶柱层析分离得到染料木素单体,并且总异黄酮含量达到84%,异黄酮收率为88.91%。 4、采用邻苯三酚自氧化法和水杨酸法研究了红车轴草总异黄酮抗氧化活性。以红车轴草为原料,经过提取纯化以后配制成不同浓度的总异黄酮溶液,采用水杨酸法和邻苯三酚法测定其对羟自由基和超氧阴离子的清除作用。结果显示,红车轴草异黄酮在0.076~1.213mg/mL范围内对羟自由基和超氧阴离子都有清除作用,并且具有较好的线性关系,并且达到50%清除率所需的异黄酮浓度(EC50)分别为0.346和0.282mg/mL,说明红车轴草异黄酮能够在体外清除自由基。


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