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肝细胞癌患者血清糖蛋白质组及其糖链结构研究

杨刚龙  
【摘要】:国际癌症研究机构的最新资料表明,肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球最常见的五种恶性肿瘤之一。从2009年起恶性肿瘤致死率已跃居我国主要疾病死亡率的首位,而其中HCC排在恶性肿瘤死亡率的第二位。HCC死亡率高的原因之一是当前肝癌的确诊通常是在晚期,因而错过了最佳的治疗时期,因此寻找一种能在发生早期快速灵敏的诊断HCC的方法就显得尤为必要。利用蛋白质组学和糖组学技术对HCC发生过程中糖蛋白及其糖基化修饰进行深入的研究,可以揭示糖蛋白在肝癌发生过程中作用和功能,探究HCC发生的分子机理,并促进临床诊断方法的发展。 第一部分:通过对Fe304磁性粒子的硅烷化修饰制备出了环氧化磁性微粒,并建立了一套利用环氧化磁性微粒制备凝集素-磁性微粒复合物(LMPCs)的方法。经表征,制备的环氧化磁性微粒是一种粒径相对均一,d(0.5)为3.50μm,饱和磁化强度为69.55emu/g,比表面积为96.29m2/g,且表面具有丰富环氧基团的超顺磁性材料。通过条件优化,在保持凝集素生物活性的前提下,确定1g磁性微粒最多可以固定186.31±5.16mg伴刀豆球蛋白凝集素(ConA)。 第二部分:利用制备的LMPCs建立了一种简单快速且高通量的凝集素-磁性微粒复合物分离N-连接糖蛋白的方法(N-glyco-LMPCs),并与质谱技术联用同时鉴定和解析糖蛋白及其糖链结构。通过CMPCs对模式蛋白中糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)的分离及结构鉴定,获得了分离的RNase B的蛋白酶切图谱,分析了其糖型的微不均一性。利用CMPCs分离健康志愿者和HCC患者血清中的糖蛋白,并利用质谱技术对分离的糖蛋白及其糖链结构进行鉴定和分析。最终从健康志愿者和HCC患者血清分别鉴定到93和85种糖蛋白,并且有21种糖蛋白只在健康志愿者血清中鉴定到,另外有13种糖蛋白只在HCC患者血清中鉴定到。同时从健康志愿者和HCC患者血清分离的糖蛋白上分别鉴定到28和30种糖链结构,并且有10种糖链结构只在健康志愿者血清中鉴定到,另外有12种糖链结构只在HCC患者血清中鉴定到。这种健康志愿者和HCC患者血清中糖蛋白和糖链结构差异被用凝集素印迹技术(lectin blotting),蛋白质印迹技术(western blott ing)和凝集素/糖抗体芯片技术(lectin/glyco-antibody microarrays)验证。结果显示健康志愿者和HCC患者血清中糖蛋白的差异不仅是蛋白质表达水平差异,且其糖基化修饰水平也存在明显差异。 第三部分:利用单凝集素-磁性微粒复合物(S-LMPCs)和多凝集素-磁性微粒复合物(M-LMPCs)的N-glyco-LMPCs法结合质谱技术分离和鉴定健康志愿者和HCC患者血清中的糖蛋白,并利用emPAI方法对两种血清中分离的糖蛋白进行定量分析。两种方法从健康志愿者和HCC患者血清中共鉴定到371种N-连接糖蛋白,且结果显示不同糖蛋白与四种凝集素(伴刀豆凝集素A,Con A;扁豆凝集素,LCA;橙黄网胞盘菌凝集素,AAL;麦胚凝集素,WGA)的结合具有特异性,初步显示了糖蛋白的糖链结构,揭示了HCC发生过程中一些糖链微结构的变化。通过非标记emPAI;定量分析,发现有315种(84.9%)糖蛋白的丰度在HCC发生过程中没有发生或者发生了很小的变化,另外有49种(13.2%)糖蛋白在HCC患者血清中高表达,有27种(7.3%)糖蛋白在HCC患者血清中低表达。其中高表达的糖蛋白中包括已经作为肝癌诊断标志物的α-甲胎蛋白以及补体蛋白C6(Component C6),免疫球蛋白轻链C(Ig mu chain C),β-2-糖蛋白(β-2-glycoprotein),G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor)等重要的HCC潜在标志物。第四部分:采用滤膜辅助的凝集素分离糖蛋白糖肽法(N-glyco-FASP)对健康志愿者和HCC患者血清中N-连接糖蛋白及其糖基化位点进行鉴定和分析。两种血清中共鉴定出137条N-连接糖肽,包含144个N-连接糖基化位点,分别来自74种糖蛋白,其中只出现在健康志愿者血清中的糖基化位点有54个,只出现在HCC癌患者血清中的糖基化位点有53个。经该方法富集后的糖肽占鉴定到的多肽的28%,相对于富集前提高了近60倍。结合N-glyco-LMPCs分离鉴定到的糖蛋白,从血清中共鉴定出451种糖蛋白,其中在健康志愿者血清中鉴定出305种,HCC患者血清中鉴定出298种,使血清中糖蛋白鉴定的覆盖率得到提高。经功能分析,发现这些糖蛋白主要分子功能是结合,催化以及酶调节活性;主要参与细胞过程,刺激应答,生物调节和代谢过程;并且主要分布在细胞中,细胞外区域,以及细胞器中。经过对只在HCC患者血清中鉴定出的蛋白质进行功能聚类分析后发现,这些蛋白主要是一类分泌性,并具有信号肽序列的糖蛋白。 第五部分:采用滤膜辅助分离全糖蛋白N-连接糖链法(N-glycan-FASP-T)和滤膜辅助的凝集素分离糖蛋白N-连接糖链法(N-glycan-FASP-L)对健康志愿者和HCC患者血清中全糖蛋白N-连接糖链和凝集素结合的糖蛋白N-连接糖链分别进行比较分析,并利用MALDI-TOF/TOF串联质谱解析糖链结构。其中两种血清经N-glycan-FASP-T法分析共鉴定出26种,且主要分布在小分子量范围;通过N-glycan-FASP-L法分析共鉴定出24种,其分布更均匀,糖链鉴定范围相对更广。其中用N-glycan-FASP-T法分析中有9种糖链同时在两种血清中鉴定到,N-glycan-FASP-L法分析中也有9种糖链同时在两种血清中鉴定到。经分析后发现无论是单独在HCC患者血清中鉴定到的(6/16)或者是初步定量分析后在HCC中相对高表达的糖链(4/5)均主要是岩藻糖化修饰的糖链。N-glycan-FASP-T法和N-glycan-FASP-L法两种分析策略对糖链的鉴定具有一定的偏好性,可以相互补充更好地分析与HCC发生相关的糖链结构。


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