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不同肿瘤基因表达分析中内参基因的选择和研究

杨波波  
【摘要】:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)已成为定量比较RNA转录丰度的快速,灵敏的方法之一。涉及到需要的重要参数有扩增效率和达到荧光阈值的循环数(Ct值),它们被用来准确计算基因mRNA的表达水平[1]。然而,目的基因与内参基因之间的PCR扩增效率的不一致,是导致最后无法进行相对定量分析的主要原因,所以没有一个单一的内参基因达到理想的内质控标准。因此,对于相对定量而言选择合适的内参基因是必要的。 本实验采用Taqman实时荧光定量PCR法检测了五种内参基因分别在29例乳腺癌、35例胃癌、42例结肠癌、44例直肠癌和42例肺癌石蜡包埋组织中的表达差异,并利用内参基因稳定性评估软件GeNorm软件、NormFinder软件和BestKeeper软件评估其稳定性和不同癌症中理想的内参基因数目。其中五个内参基因符合高效且一致的扩增效率。根据不同软件内参基因稳定性评估参数,GeNorm软件分析表明在肺癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌中最稳定的内参基因分别为大核糖体蛋白(RPLPO),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞骨架肌动蛋白(ACTB)和RPLPO, ACTB、RPLPO和转铁蛋白受体(TFRC),ACTB和ACTB;NormFinder软件分析表明在肺癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌中最稳定的内参基因分别为RPLPO, GAPDH, ACTB,ACTB, ACTB;BestKeeper软件分析表明在肺癌、直肠癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌中最稳定的内参基因分别为RPLPO, GAPDH, GAPDH, GAPDH, ACTB。对三个软件的结果综合分析,并根据稳定性综合排序,发现肺癌中选择RPLPO为内参基因来标准化目的基因数据,在直肠癌中选择GAPDH, ACTB和RPLPO为内参基因来标准化目的基因数据,在胃癌中选择ACTB,RPLPO和TFRC为内参基因来标准化目的基因数据,在乳腺癌中选择TCTB为内参基因来标准化目的基因数据,在结肠癌中选择ACTB为内参基因来标准化目的基因数据。在肺癌,乳腺癌,直肠癌和结肠癌中最不稳定的内参基因为TFRC,在胃癌中最不稳定的内参基因为β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)。 运用以上所选择的的内参基因对不同肿瘤样本中的目的基因表达水平进行标准化,得到目的基因的相对表达量值,其中对于选择多个内参基因作为参考基因的样本,运用几何平均数的算法计算平均Ct值,并比较目的基因在不同肿瘤之间组织差异性和相关性分析。研究结果表明大多数基因在不同肿瘤之间表达水平是具有显著性差异的。同时乳腺癌中的TYMS基因和STMN1基因,胃癌中的STMN1基因和TOP2A基因的表达水平具有高度相关性,相关系数分别为:r=0.891, P0.0001;r=0.824,P0.0001。此外,对中度相关系数大于0.5的相关基因绘制图表,通过比较得到本课题内参基因选择是准确合适的。


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