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鲁米诺—氯金酸—溶菌酶发光体系在药物分析中的应用

刘晓庆  
【摘要】:蛋白质与药物小分子相互作用的探讨对于新药的研发有着重要的理论指导意义。本论文采用流动注射化学发光法(Flow Injection Chemiluminescence, FI-CL),以鲁米诺(Luminol)为发光探针,纳米金为发光增敏剂,建立了Luminol-HAuCl4-Lysozyme化学发光(Chemiluminescence, CL)体系;研究了溶菌酶(Lysozyme)与大环内酯类、磺胺类、酚酸类等药物分子的相互作用,得到了相互作用的结合参数、热力学参数;该体系成功应用于连续监测人体尿液中卡托普利、罗红霉素含量。本论文内容包括如下两个部分:第一部分综述第一章绪论介绍了流动注射化学发光法及纳米材料在发光分析中的应用进展,归纳了蛋白质和小分子相互作用常用的研究方法以及近几年来Lysozyme与小分子相互作用研究状况,提出本论文研究意义及内容。第二部分研究报告第二章鲁米诺-氯金酸-溶菌酶化学发光体系的建立实验发现HAuCl4在Luminol溶液中可以在线生成金纳米粒子进而可以增强Luminol化学发光强度,建立了Luminol-HAuCl4-Lysozyme CL体系。最佳实验条件为Luminol: 2.5×10-5mol L-1, Lysozyme:1.0 × 10-7 mol L-1, HAuCl4:5.0 × 10-7 mol L-1, NaOH:2.5 × 10-2 mol L-1,流速:2.0 mL min-1及混合管长度:10.0 cm;对该体系的稳定性进行了考察,结果表明在5天内流动体系每天持续运行8小时,RSDs值均小于3.5%,说明该体系具有良好的稳定性。第三章溶菌酶与大环内酯类、磺胺类、酚酸类药物相互作用研究以大环内酯类、磺胺类、酚酸类药物会猝灭Luminol-HAuCl4-Lysozyme体系的化学发光强度为基础,且化学发光强度的降低值ΔI与药物浓度的对数LnC之间呈现良好的线性关系,建立了线性方程△I=ALnC+B (A, B定义为灵敏度因子和作用因子)。根据蛋白质与小分子相互作用FI-CL模型,lg[(Io-I)/I]=nlg[C]+LgK,计算得出Lysozyme与药物小分子相互作用的结合常数K在104~107 L m01-1数量级之间,结合位点数n接近于1。依据Van't Hoff方程,计算得到热力学参数(△H、ΔS和ΔG),分析表明Lysozyme与大环内酯类、磺胺类、酚酸类药物分子之间相互作用为自发的过程。用分子对接法对二者相互作用进行研究,发现药物分子均进到Lysozyme的疏水沟槽中,且ΔG、K值均与FI-CL实验结果的数值基本是一致的。第四章连续监测人体尿液中卡托普利含量以卡托普利(Captopril,CAP)能够猝灭Luminol-HAuCl4-Lysozyme体系的化学发光强度为基础,建立了一种快速灵敏的测定CAP新方法。发光强度的降低值ΔI与CAP浓度的对数值LnCCAP在0.1-50.0ng mL-1范围内呈现比较好的线性关系(LOD:0.03 ng mL-1,RSDs3.O%)。当流速为2.0 mL min-1时,完成一次分析测定过程需要36 s。应用FI-CL模型,lg[(Io-I)/I]=NLG[C]+lgK计算得到结合常数K为7.8×105 Lmol-1,结合位点数n为0.75。根据van't Hoff方程,得出热力学常数△H(42.32 KJ mol-1)、△S(255.65 J mor-1 K-1)、△G(-31.43/-33.60/-36.56 KJ mol-1,288/298/308K),说明Lysozyme与CAP的相互作用是一个自发进行的熵驱动反应,且主要作用力是疏水作用力。结合分子对接技术可知CAP进入Lysozyme的疏水空腔中与Trp63结合形成1:1的复合物猝灭化学发光。本方法简便快速并成功应用于连续监测志愿者口服CAP后7.5 h内尿液中药物含量变化,获得CAP代谢动力学参数(Ka:2.8l±0.05 h-1,Ke:0.88±0.02 h-1,t1/2:0.79±0.01 h).本工作发表在SCI源期刊Instrumentation Science Technology(2015,43,197-213)。第五章连续监测人体尿液中罗红霉素含量基于罗红霉素(Roxithromycin,ROX)能够猝灭Luminol-HAuCl4-Lysozyme体系的化学发光强度,并且发光强度的减小值Ⅳ与ROX浓度的对数值LnCROX在0.03-70.0ng mL-1范围内呈现出比较满意得线性关系,从而建立了一种快速检测ROX的方法,此方法LOD为0.01 ng mL-1,RSDs3.0%。通过FI-CL模型计算得到Lyspzyme与ROX相互作用结合常数K(2.1×105 Lm01-1),结合位点数n(0.73),说明二者有一个结合位点;由△H(21.21 KJ moL-1),△S(173.18 J mol-1 K-1),可知疏水作用为二者复合物的主要稳定力并且是一个熵驱动过程。△G(-28.67/-30.36/-32.13 KJ mol-1,288,298,308K)表明二者自发形成Lysozyme-ROX复合物。本方法简便快速并成功应用于连续监测志愿者口服ROX后14.0 h内尿液中药物含量变化,获得ROX代谢动力学参数(Ka:1.152±0.05 h-1,Ke:0.092±0.01 h-1,t1/2:7.52±1.01 h)。


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