纳米通道单分子分析新体系的研究及应用

【摘要】：纳米通道单分子技术是一种无需标记、无需扩增、高通量和高选择性的分析技术。已广泛应用于DNA测序、蛋白质构象分析、生物大分子相互作用研究以及多种物质的单分子检测,如DNA/RNA、多肽、蛋白质、有机小分子和金属离子等。该项技术的原理是通过记录单个分析物通过纳米通道时产生的电流阻塞信号对分析物进行分析和表征。α-溶血素(α-hemolysin,α-HL)蛋白质纳米通道具有结构明确、易于基因工程修饰等优势,是目前应用最为广泛的生物纳米分析通道。传统的纳米通道单分子分析电解质为KCl/NaCl,该电解质一般不与分析物或纳米通道发生特异性相互作用,体系噪音较大,信号分辨率较低,难以实现对多种分析物的高选择性检测。基于此,本论文利用α-HL七聚体作为纳米通道,使用四甲基氯化按(Tetramethylammonium Chloride,TMA-Cl)或盐酸胍(Guanidine Hydrochloride,GdnHCl)作为电解质替代KCl/NaCl,构建了两个新型纳米通道单分子分析体系。利用电解质离子与分析物或磷脂双分子层的相互作用,研究新型纳米通道单分子分析体系的性质并实现对特定分析物的检测和分析。具体研究内容如下:1、文献综述:简要综述了纳米通道单分子分析技术的发展历史、检测原理,纳米通道的分类及其在DNA测序、表观遗传物质检测和蛋白质构象分析方面的研究进展。2、α-HL单体蛋白的制备及其纳米通道的组装:制备了α-HL单体蛋白质并组装获得七聚体纳米通道。采用原核表达体系替代无细胞蛋白表达系统(In Vitro Transcription and Translation,IVTT),实现α-HL单体蛋白质的大量制备。表达菌株选取大肠杆菌E.coil BL-21(DE3)pLysS,分别采用离子交换凝胶纯化法、尺寸排阻色谱纯化法、超滤膜分子量截留纯化法纯化α-HL单体蛋白,得到纯度较高的α-HL,在兔血红细胞膜上聚合形成α-HL七聚体(α-HL)7。膜片钳放大器检验α-HL七聚体蛋白的活性,检测七聚体纳米通道的通道电流及通道的稳定性和性质,为充分认识生物蛋白纳米通道及其在单分子分析中的应用提供了研究基础。3、(α-HL)7/TMA-Cl纳米通道分析新体系的建立:构建了基于TMA-Cl电解液的α-HL纳米通道单分子分析体系。使用TMA-Cl替代KCl/NaCl作为纳米通道单分子分析的电解质,研究发现(α-HL)7/TMA-Cl体系具有如下特征:(1)α-HL蛋白纳米通道的基质磷脂双分子层稳定性提高了至少6倍;(2)明显降低了单通道记录的电流噪音;(3)防止更多的α-HL七聚体蛋白质插入磷脂双分子层,延长单通道的持续时间;(4)明显降低ssDNA穿过纳米通道的速度;(5)增加纳米通道对DNA的捕获速率;(6)可应用于多核苷酸链的检测和区分。4、(α-HL)7/TMA-Cl纳米通道分析新体系的应用——快速精准检测DNA甲基化:基于TMA和甲基化胞嘧啶的甲基之间的相互作用,在(α-HL)7/TMA-Cl纳米通道分析新体系(TMA-NP)中实现了对甲基化DNA的快速精准检测。该体系检测DNA甲基化有如下优势:(1)TMA能插入甲基胞嘧啶-鸟嘌呤(mC-G)结构,有效减小mC-G的氢键键能2.24倍,增大C-G和mC-G的键能差异。(2)TMA能增强A-T的键能使其与C-G相等,因此(α-HL)7/TMA-Cl体系可消除DNA链的碱基组成对甲基化检测的影响,实现高灵敏、高准确性地检测甲基化DNA。该体系可直接检测和区分不同甲基化水平的发卡/单链DNA,无需对DNA进行重亚硫酸盐转化、化学修饰和扩增,可应用于表观遗传学研究的快速分析。5、(α-HL)7/GdnHCl纳米通道分析新体系的建立及应用:构建了基于GdnHCl电解液的α-HL纳米通道单分子分析体系。基于GdnHCl对疏水作用力和氢键的破坏作用,使用GdnHCl替代KCl/NaCl作为纳米通道单分子分析的电解质。该体系中能形成稳定、无背景信号的α-HL纳米通道,此通道呈线性、对称的电流电压关系,分析β环糊精(βcyclodextrin,βCD)电流信号发现其内部空腔的疏水结构发生改变。基于该体系实现了α-HL 纳米通道对 βCD 与盐酸 1-金刚烷胺(1-Amantadine hydrochloride,1-AdNH2 HCl)复合物的直接捕获,为药物包裹体系的靶向和控制给药提供了新的思路。并且,在该体系中成功区分了 Trp-cage蛋白(Trp-cage miniprotein)在GdnHCl变性剂中的折叠态和去折叠态。