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基于iTRAQ蛋白质组学技术分析茉莉酸甲酯对甘遂乳汁管中自噬的影响

方晓艾  
【摘要】:茉莉酸甲酯(MeJA)是一种普遍存在的植物激素,有助于植物抵抗各种生物及非生物胁迫,对植物的生长发育也有一定影响。甘遂(Euphorbia kansui Liou)是中国传统的中药材,主要用于治疗肿瘤、咳喘、血吸虫病等。甘遂的药用成分主要合成并分布于乳汁管中。近来研究发现,MeJA可以诱导橡胶树(Hevea brasiliensis Willd.)次生乳汁管的分化,并可以增加乳汁中次生代谢产物的产量。此外,有研究表明细胞自噬参与甘遂乳汁管的发育,但是目前,MeJA对甘遂乳汁管发育的影响还未见报道,甘遂乳汁管发育过程中细胞自噬的发生机制尚不清楚。鉴于此,本研究以甘遂为研究对象,对其进行不同时间的MeJA处理,以蛋白质组学技术为基础,然后分别从分子转录水平、蛋白质翻译水平及亚细胞水平多维度地探究MeJA对甘遂乳汁管发育的影响,并利用酵母双杂交技术,从蛋白质互作水平探究甘遂乳汁管发育相关蛋白ATG18a的互作蛋白,拟为进一步研究甘遂乳汁管细胞自噬发生的分子机制及其对MeJA的响应机理提供基础资料。具体研究结果如下:(1)MeJA促进甘遂乳汁中自噬溶酶体途径及ROS途径相关蛋白的表达通过基于i TRAQ技术的蛋白质组学对MeJA处理下的甘遂的乳汁蛋白进行分析,挖掘甘遂乳汁管发育相关蛋白,从蛋白水平上分析MeJA对甘遂乳汁管发育的影响。蛋白质组学中共鉴定到总蛋白509个,其中包括297个得到注释的蛋白及29个差异表达蛋白。这些差异表达蛋白主要涉及了糖代谢途径,抗病原菌机制,溶酶体自噬途径及活性氧(ROS)途径等。从中挑选了4个感兴趣的蛋白(基因):溶酶体自噬途径的α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)及半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease),ROS途径的铜/锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase),并对上述蛋白的基因分别设计引物,通过RT-qPCR技术对这些基因的转录表达进行分析。结果显示:经MeJA处理后,这些基因在转录水平的表达模式与其蛋白积累的变化模式一致,MeJA促进了甘遂乳汁中自噬溶酶体途径及ROS途径相关蛋白的表达。(2)MeJA促进甘遂乳汁管中的自噬对一些自噬相关蛋白包括ATG1c、ATG3、ATG7、ATG8s、ATG18s进行了转录水平的RT-qPCR分析,结果显示,MeJA处理后这些自噬相关蛋白在转录水平均出现上调,且在MeJA处理36h达高峰,随后下降,其中,ATG18a转录水平的上调尤为显著。此外,在响应MeJA的甘遂乳汁蛋白质组学数据中,我们也只鉴定到一个自噬相关蛋白,即ATG18a,且其积累在不同的处理时间也有显著差异。于是我们获得ATG18a的转录组序列,进行基因克隆和原核表达获得Anti-ATG18a抗体,然后结合通用的自噬监控蛋白ATG8分析MeJA对自噬的影响。Western Blot的结果显示MeJA处理后ATG8和ATG18a的积累均增加。以单丹磺酰尸胺(MDC)为探针,联合Anti-ATG8-Alexa Fluor488/Anti-ATG18a-Alexa Fluor 488对甘遂不同发育时期的茎利用激光共聚焦扫描电子显微镜进行观察,发现ATG8/ATG18a和MDC探针可以共定位于甘遂乳汁管中的自噬体上,且荧光强度随乳汁管的发育呈弱-强-弱的趋势,这和乳汁管细胞的发育过程相一致。而且,在处于相同发育阶段的乳汁管中,MeJA处理后ATG8和ATG18a的荧光强度变得更强,表现为:MeJA36MeJA48CK。最后,通过透射电子显微镜(TEM)观察发现MeJA处理后,乳汁管细胞中自噬体的数量明显增多,主要表现为线粒体自噬。(3)甘遂乳汁管中ATG18a可能与RaBD2c发生相互作用在甘遂中,通过酵母双杂交技术,并结合双分子荧光互补(Bi FC)技术寻找与ATG18a发生互作的蛋白。在甘遂的c DNA文库中筛选到了15个阳性克隆,然后从其中挑选了6个蛋白,包括:26S蛋白酶体调控亚基S10B、RaBD2c、60S核糖体蛋白L37a、半胱氨酸蛋白酶、延长因子Tu、60S核糖体蛋白23,进行回转酵母验证实验,剔除了一个假阳性互作蛋白,60S核糖体蛋白23。最后,从剩下的5个蛋白中,挑选了3个蛋白,即26S蛋白酶体调控亚基S10B、RaBD2c和半胱氨酸蛋白酶进行BiFC验证,最终结果显示,RaBD2c与ATG18a之间存在互作关系。综上所述,MeJA作为一种外源性激素,促进了甘遂乳汁管细胞中自噬的发生,而且可能是通过提高ROS水平促进了线粒体自噬。此外,甘遂乳汁管中蛋白含量较高的自噬相关蛋白ATG18a与RaBD2c发生较强的相互作用,可能参与甘遂乳汁管中细胞自噬对MeJA的响应,但其机理尚需进一步的研究。


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