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小麦NBS-LRR抗性基因克隆以及基因枪介导的遗传转化和由发根农杆菌介导的苦荞遗传转化

黄萱  
【摘要】:本论文的主要研究内容包括:(Ⅰ)通过基因枪遗传转化法轰击小麦未成熟胚,获得携带有水稻几丁质酶基因RC24的转基因小麦,对T_0和T_1代转基因小麦植株的条锈病抗性进行了研究。(Ⅱ)根据己知抗病基因的保守序列设计引物,分离克隆小麦NBS-LRR类基因同源序列,获得三条与已知抗病基因同源的序列,并通过Northern印迹杂交技术分析了这三条序列的时空表达情况。(Ⅲ)建立了苦荞的植株再生体系及发根农杆菌遗传转化体系,对获得的再生植株和毛状根中次生代谢产物芦丁的含量进行了测定。 Ⅰ.以预培养3-4d的冬小麦品种西农88、宝丰7228、黑小麦、盐2、80101T、甘麦、西农1376和西农8727开花受粉8~15d后的未成熟胚(大小为0.8~1.5mm)为材料,利用基因枪(型号:PDS1000/氦气)将水稻几丁质酶基因导入小麦未成熟胚盾片组织。转化过程中一共采用了三种质粒组合,质粒pYA024(含有水稻几丁质酶基因RC24和选择标记基因npt Ⅱ)轰击的小麦未成熟胚转至附加150mg/L硫酸卡那霉素的培养基上进行筛选和分化;质粒组合pARN6+pDB1(前者含水稻几丁质酶基因RC24,后者含β-葡糖苷酸酶基因gus和选择标记基因bar)和pBAB3(含水稻几丁质酶基因RC24)+pDB1轰击的小麦未成熟胚转至附加2mg/L除草剂PPT的培养基上进行筛选和分化。小麦未成熟胚在经过轰击、筛选和分化后,获得5株再生绿苗。PCR和Southern印迹分析结果显示,5株再生植株中4株为阳性,其中质粒pYA024轰击后获得1株,质粒组合pARN6+pDB1轰击后获得1株,质粒组合pBAB3+pOB1轰击后获得2株,平均转化频率为0.30%。不同基因型小麦的转化频率表现出非常显著的差异:西农88的转化效果最好,转化频率可达1.38%;其次是宝丰7288,转化频率为0.59%;甘麦的转化频率为0.49%从西农1376、黑小麦、盐2、80101T和西农8727没有获得转基因植株。对转基因小麦进行形态学观察发现,与对照相比T_0代转化植株的分蘖数、株籽粒数、千粒重、株高、穗长、节间数等均无叫显变化。田间抗条锈菌实验结果表明,西农88T_0和T_1代转基因小麦的抗病性最好,为近免疫性,宝丰7228和甘麦


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