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大肠杆菌高密度发酵制备重组人金属硫蛋白-Ⅲ

李聪  
【摘要】: 本文首次对大肠杆菌生产重组人金属硫蛋白-Ⅲ(rhMT-Ⅲ)的高密度发酵工艺进行了研究。从发酵培养基、控制溶氧量、补料方式、诱导方法等方面进行了优化。最终在5 L发酵罐中,大肠杆菌湿菌重最高可达140 g/L,目标融合蛋白约占全菌总蛋白的23%以上。对菌体进行分离纯化,rhMT-Ⅲ得率约为每升菌液90毫克蛋白,纯度80%以上。 论文包括四个部分: 1.文献综述 首先对金属硫蛋白及金属硫蛋白-Ⅲ的理化性质、结构特点、生物学功能等方面的研究进行综述:并概述了大肠杆菌高密度发酵的基本情况。最后简述了金属硫蛋白的制备方法及本论文的研究目的和意义。 2.重组大肠杆菌摇瓶发酵工艺的研究 用单因素实验确定培养基主要成分,并对诱导剂浓度、表达时间及诱导方式等对菌体生长及目的蛋白表达的影响进行了研究。结果表明添加IPTG及乳糖复合诱导的方式是可行的。 3.重组大肠杆菌在5L发酵罐高密度发酵工艺的研究 以摇瓶发酵的结果为基础,在5 L发酵罐中,采用平衡DO-stat法,通过搅拌、通入富氧、控制补料流加、优化诱导时机等方法,实现了大肠杆菌的高密度发酵。碳源为甘油时,在菌体生长的对数中后期加入IPTG诱导,湿菌重最高可达115 g/L,融合蛋白表达约占全菌蛋白的23.88%。碳源为葡萄糖时,在菌体生长对数中期加入IPTG及乳糖复合诱导的方式,湿菌重最高可达140 g/L,融合蛋白表达约占全菌蛋白的23.01%。 4.重组人MT-Ⅲ的分离纯化及检测 高密度发酵所收获的菌体,经超声破碎、亲和层析、凝血酶酶切、分子筛分离等步骤,最终rhMT-Ⅲ的得率约为每升菌液90毫克蛋白。用ELISA对蛋白纯度进行测定,结果表明蛋白含量在80%以上,DTNB巯基法测得巯基含量与理论值基本吻合。


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