大豆根际氢氧化细菌的分离及特性研究

【摘要】： 2002年Dong博士首次提出Hup~-豆科根瘤释放的H_2能够促进根际氢氧化细菌的生长，并进一步促进植物生长。但是由于氢氧化细菌的分离极其困难，对氢氧化细菌的种群结构及相关特性研究还比较少。本论文以陕西关中地区Hup~-大豆根际土壤为研究材料，在通入H_2混合气体的培养条件下，以H_2为唯一能源、CO_2为主要碳源，对土壤氢氧化细菌进行了分离纯化，并对分离菌株的理化特性进行了初步研究。具体内容如下： 建立了一套氢气培养系统装置。该装置通过电解水的方式产生H_2，与通入的空气混合，形成流速为280ml·min~(-1)，含H_2量为4.16×10~(-5)～1.25×10~(-4)mol·L~(-1)的混合气体。利用该装置进行土壤富集培养和氢氧化细菌培养。 采集的Hup~-大豆根际土壤，在通入4.16×10~(-5)mol·L~(-1)H_2混合气体的条件下，富集培养1个月，对土壤耗氢能力进行了持续监测，土壤残余H_2浓度从富集培养开始时的4.00×10~(-5)mol·L~(-1)降至5.40×10~(-6)mol·L~(-1)，并且基本维持稳定，表明土壤中的氢氧化细菌种群数量大量增加。采用灭菌和加抑菌剂方法处理富集培养的土壤后，再通入4.16×10~(-5)mol·L~(-1)H_2混合气体培养，考察土壤耗氢能力的变化情况。结果表明灭菌土壤土壤不具有氧化H_2的能力；链霉素处理的土壤在第24h时的耗氢能力减少了58.21±9.4％，第2周时的单位土壤耗氢能力减少了96.06±2.3％；用苯来特处理的土壤，在第24h的单位土壤耗氢能力减少了86.85±5.9％，第2周时的耗氢能力减少了22.16±6.7％，耗氢能力与刚处理时相比有较大的回升。这些结果说明：①土壤具有耗氢能力是微生物氧化H_2作用引起的；②土壤中起氧化H_2作用的微生物，是细菌而不是真菌。 采用无机盐固体培养基，通入含H_2量为1.25×10~(-4)mol·L~(-1)的混合气体，以H_2作为唯一能源分离出细菌40株。用气相色谱测定菌株耗氢能力，结果显示有22株菌的吸氢值大于1.25×10~(-4)mol·L~(-1)，占测定菌株总数的55％；其中9株菌将试管中的H_2全部耗尽，占测定菌株总数的22.5％，占22株菌株数的40.9％。对20株细菌进行了自养生长试验，结果表明20株菌均能利用H_2为能源，以CO_2为主要碳源进行无机化能自养生长。初步判断这20株细菌为氢氧化细菌。 对20株氢氧化细菌进行了菌落形态、菌体特征及生理生化特征测定。结果表明：①所筛选的大部分细菌菌体较小，电镜观察细菌以杆状居多；②过氧化氢酶和氨的产生试验结果均为阳性，葡萄糖产酸产气、V.P试验、甲基红试验、3-酮基乳糖和苯丙氨酸脱氨酶试验结果均为阴性；③不通H_2混合气体的条件下，这些菌株都能够利用葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉三种碳源，但是对木糖、果糖、蔗糖3种碳源的利用情况不同。 对20株氢氧化细菌进行了小麦和玉米促生试验，其中用A03、A06、A10、A11、A14、A26、A31、A35、A39等9株菌的菌悬液处理的小麦和玉米的根长都显著优于对照组和大肠杆菌处理组，增长幅度为117％～397％,其中菌株A06处理的小麦根相对生长361％、玉米根相对生长226.3％，菌株A11处理的小麦根相对生长397.6％，、玉米根相对生长219.7％。 对这9株氢氧化细菌通过薄层层析的方法检测菌株对ACC这种非蛋白氨基酸的利用，判断菌株是否具有ACC脱氨酶，层析结果表明菌株A06能够利用ACC这种非蛋白氨基酸作为氮源。本试验考察了pH值和温度环境胁迫下A06菌株对小麦初生苗的影响，结果表明在较高pH值、较低pH值时及高低温时的缓解效果并不明显。对A06菌株进行了16s rDNA扩增及序列测定，结果显示菌株A06与多个Variovorax paradoxus菌株的序列相似程度达100％，结合生理生化特征，判断该菌株属于Variovorax paradoxus。