收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

结合聚合连接反应和磁性分离系统的单核苷酸多态性检测方法的建立

唐一通  
【摘要】: 随着大量与人类疾病和药物治疗相关的单核苷酸多态性(Single-Nucleotide Polymorphism, SNP)的发现,出现了多种对SNP进行检测的方法和技术。然而,大多数方法由于受到检测灵敏度低,需要昂贵的实验设备及试剂,或需要专业操作人员等方面的限制,无法在常规的临床检验中推广使用。 设计特定组成和功能的检测探针,建立了一种对SNP位点、短片段插入或缺失位点进行分型检测的新方法。该法主要包括以下几个步骤:(1)对SNP位点所在片段进行PCR扩增;(2)在DNA聚合酶的延伸作用(Fill-in)和DNA连接酶的连接作用(Ligation)双重特异性保证的基础上,对等位基因的检测位点进行识别;(3)基于磁分离技术的原理,使用链亲和素磁性微粒对含有检测位点等位基因特异性片段进行纯化,减少反应体系中其它成分对后续分型检测的影响,进一步增强检测体系的特异性。(4)对纯化后的等位基因特异性片段进行扩增以增加检测灵敏度;(5)通过琼脂糖凝胶电泳、ELISA检测或通用寡核苷酸芯片技术三种不同方式实现分型检测。 琼脂糖凝胶电泳和ELISA检测实现的分型,不需依靠昂贵的检测仪器及试剂,即可达到快速、特异性好和灵敏度高等特点,该法能够在常规实验室实现对肿瘤组织等不均一样本进行低拷贝等位基因的检测。如果利用通用寡核苷酸芯片技术实现基因分型,可以使用单色荧光标记系统,以简单的荧光扫描设备和简便的结果分析方法实现中、高通量的SNP分型检测。 以苯二异硫氰酸酯(p-phenylene diisothiocyanate/1,4-phenylene diisothiocyanate, PDC)作为双功能交联剂,对氨基末端磁性微粒的表面进行修饰而制备活化磁性微粒。通过将链亲和素共价偶联于活化磁性微粒表面而制备链亲和素磁性微粒用于SNP分型检测研究。 用聚合连接反应-琼脂糖凝胶电泳方法对药物代谢酶基因CYP3A4、CYP2B6和药物靶点基因EGFR(Epidermal growth factor receptor)的8个SNP位点和一个短片段插入/缺失位点进行了检测,结果表明,此方法具有很好的特异性和灵敏度,能够将仅占0.5%比例的突变型等位基因从混合样本中检测出来。对35例非小细胞肺癌组织样本EGFR,c.2573T>G(L858R)位点的检测结果显示,用聚合连接反应-琼脂糖凝胶电泳方法能够检测出8例杂合子样本,而用常规的直接测序方法仅能够检测出2例杂合子样本。表明此方法具有较高的灵敏度,适合于对肿瘤等不均一组织样本的SNP检测研究。和琼脂糖凝胶检测方法相比,8例杂合子样本的酶联免疫检测结果,其阳性和阴性信号的对比结果更为明显,表明ELISA显色具有更高的灵敏度,同时可实现更大的通量。 以聚合连接反应-通用寡核苷酸检测芯片对药物代谢酶相关SNP检测的技术进行了初步研究,药物代谢酶CYP2D6基因上的7个SNP位点进行芯片检测,各个位点的阳性杂交区域均具有明显的荧光信号值,并且具有明显的阳性和阴性信号对比,显示了建立的聚合连接反应-通用寡核苷酸芯片检测方法能够应用于中、高通量SNP检测。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 patricia V.King ,Robert W.Blakesley ,陶云霞;用于转化实验的最佳DNA连接反应[J];中国生物工程杂志;1987年06期
2 汪维鹏;倪坤仪;周国华;;单核苷酸多态性检测方法的研究进展[J];遗传;2006年01期
3 刘斌;羊小海;王柯敏;谭蔚泓;;基于线性荧光探针对T4 DNA连接酶的活性分析[J];高等学校化学学报;2010年03期
4 党喜同,贾弘褆,张廼蘅;DNA也具有酶活性[J];生命的化学;1996年05期
5 包永德,朱莹书,刘金富,梁镇和,于大文,姚曼华,高翔,申同健,蒋美岩,颜茂恭,赵玉枫;酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端(36~45)CP~(m~1)IpψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的合成[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1984年01期
6 周复春,李学伍,吴斌,陈焕春;一种克隆PCR产物的新方法[J];生物技术;1996年03期
7 汪维鹏;倪坤仪;周国华;;连接反应介导的等位基因特异性扩增-微流控芯片电泳法同时检测多个SNP位点[J];高等学校化学学报;2006年10期
8 陈慧勇;罗赛群;吴珍芳;;猪的全基因组水平SNP研究现状[J];生命科学;2011年04期
9 刘传暄;马清钧;苏国富;;碱性磷酸单酯酶在DNA体外重组试验中的应用[J];军事医学科学院院刊;1983年06期
10 徐东平,施红,韩凤连;对PCR扩增片段克隆操作的几点体会[J];生物技术;1997年03期
11 方玉达,陈佩度,刘大钧,刘耀光;用温度循环提高DNA连接效率(简报)[J];农业生物技术学报;1999年02期
12 陈慎;;DNA连接酶及其应用[J];生物化学与生物物理进展;1977年06期
13 谭慎操,胡美浩;固相T4-RNA连接酶[J];北京大学学报(自然科学版);1982年01期
14 刘银坤,谌章群,刘新垣,顾天爵;2′—5′寡聚腺苷酸衍生物的研究——Ⅰ.以2′-5′寡聚腺苷酸作为T_4-RNA连接酶的供体和受体合成其衍生物的方法[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1984年04期
15 钱苏雯;李载平;;人的转化生长因子-α(TGF-α)基因的化学合成和克隆[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1987年05期
16 陈严,汤敏谦;快速高效的DNA连接[J];遗传;1999年02期
17 吴仁龙,毛敏伟,包俊茹,梁镇和,汪成尧,陈常庆;酵母丙氨酸转移核糖核酸中十三核苷酸(23~35)类似物(CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIpGp)的合成[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1984年01期
18 梁镇和,汪成尧,裘慕绥,邹碧燕,商金宝,龚佩娟,袁家珪;酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23~35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1984年02期
19 莫宁萍;岳昌武;刘坤祥;凌锌;;连接方法对重组效率影响的比较研究[J];安徽农业科学;2008年08期
20 许超;周亚凤;张先恩;;连接酶介导的生物分子检测技术[J];生物工程学报;2009年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 余爱荣;辛华雯;刘慧明;吴笑春;李罄;;中国肾移植患者钙蛋白酶10基因多态性与移植后糖尿病的相关性研究[A];2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集[C];2011年
2 刘齐元;朱腾义;程元强;范东东;;烟草atp6基因SNP的错配碱基法检测及其与CMS的相关性[A];2010中国作物学会学术年会论文摘要集[C];2010年
3 谢焱;周新;刘松梅;胡一敏;邓冠华;;2型糖尿病相关基因SNP位点通用基因芯片研制[A];中国心脏大会(CHC)2011暨北京国际心血管病论坛论文集[C];2011年
4 陈磊;郭亦杰;周继鹏;李慕朋;王英;李元建;陈小平;;中国汉族人群DDAH1功能性SNP的研究及对ADMA代谢的影响[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年
5 于清;李长贵;;hURAT1基因启动子区-87C/T SNP与原发性痛风的关联与功能研究[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年
6 陈慧勇;罗赛群;吴珍芳;;猪的全基因组水平SNP研究现状[A];培育生物产业,发展绿色经济——第五届中国生物产业大会·2011基因科学与产业发展论坛会刊[C];2011年
7 甘建伉;肖雄;黄剑平;罗庆斌;张细权;;鸡HspA9基因5′侧翼区SNP对耐热性状的影响[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
8 张荣;谢亮;聂庆华;饶友生;张细权;;利用SNP分型芯片分析鸡基因组的拷贝数目变异[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
9 孙玲;余少波;刘榜;;猪Nudt6基因克隆以及与眼肌面积性状相关SNP发现[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
10 刘楚新;孙亚奇;刘榜;;猪sANK1基因SNP的筛查以及与经济性状的关联分析和表达谱分析[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 唐一通;结合聚合连接反应和磁性分离系统的单核苷酸多态性检测方法的建立[D];西北大学;2010年
2 高汝飞;西方人群中蛋白质酪氨酸激酶JAK2~(V617F)突变体与邻近SNPs之间相关性的分析及JAK2~(V617F)检测新方法的建立[D];吉林大学;2011年
3 成永强;利用滚环扩增和纳米粒子均相无标记检测核酸的研究[D];河北大学;2008年
4 张志毅;调控性SNP结构特征的生物信息学分析和分子动力学模拟研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
5 谢为博;基于表达谱芯片和新一代测序技术的高通量基因分型方法的开发[D];华中农业大学;2010年
6 张建勇;中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)基因组SNP标记的开发与应用[D];中国海洋大学;2011年
7 张良芬;编码梅毒螺旋体47-、17-和15kD脂蛋白的基因克隆、表达及表达产物反应原性的初步鉴定[D];中国协和医科大学;2001年
8 王峻;单核苷酸多态性分析算法的研究与应用[D];哈尔滨工业大学;2010年
9 王峻;单核苷酸多态性分析算法的研究与应用[D];哈尔滨工业大学;2010年
10 王虎林;Klotho基因G-395A多态性与原发性高血压的关联研究及功能分析[D];第三军医大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张锦超;DNA聚合酶—连接酶检测顺铂代谢相关基因SNP方法的建立[D];西北大学;2011年
2 魏悦爽;从肌钙蛋白相关基因筛选举重运动员选材用分子标记[D];北京体育大学;2010年
3 毕煜;初探应用关联规则筛选与癌症有关联性的SNP[D];复旦大学;2010年
4 田小春;Klotho三个位点SNP及组合在重庆汉族老年人群分布及其与原发性骨质疏松症的关系[D];重庆医科大学;2011年
5 杨谷;荧光光谱分析鉴别SNP等位位点比例法产前诊断唐氏综合征方法的建立和应用[D];苏州大学;2010年
6 孟轩;基于纳米金颗粒和无标记核酸探针的SNP检测技术研究[D];南华大学;2011年
7 汤栩宁;基于单体型的致病基因区域发现算法研究[D];吉林大学;2008年
8 靳鹏;不同地理种群黑线仓鼠FSHβ部分序列克隆与SNP分析[D];曲阜师范大学;2010年
9 刘璐;黑线仓鼠OB基因部分序列的克隆与SNP分析[D];曲阜师范大学;2010年
10 张素华;X染色体上STR与SNP标记的分型检测[D];苏州大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 程书权;抗癌中药及其制剂研究进展[N];中国医药报;2002年
2 Marvin;测基因而知天命?[N];经济观察报;2009年
3 记者 常丽君;“人以群分”受基因构成影响[N];科技日报;2011年
4 王佑;中国石化或80亿美元洽购加油气公司Addax[N];第一财经日报;2009年
5 许铁男;要拿金钱“赌”明天[N];医药经济报;2001年
6 记者 陈卫东;人类基因组南方研究中心 10年成就显著[N];科技日报;2008年
7 通讯员 李科;永州文化产业渐入佳境[N];永州日报;2009年
8 吴奥湘;湖南组织四大印刷产业项目亮相“港澳洽谈周”[N];中国包装报;2009年
9 记者 李雪墨;创新药研究存在三个瓶颈[N];中国高新技术产业导报;2001年
10 本报记者 徐瑞哲;学者发现:汉族祖先来自非洲[N];解放日报;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978