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禽流感病毒血凝素的分离纯化以及快速评估其宿主特异性方法的研究

孙宇  
【摘要】: 研究背景:血凝素是流感病毒表面的最主要的蛋白成分,在细胞吸附、穿膜、感染等方面起重要作用,其变异性很强,是流感病毒发生抗原变异的主要原因。血凝素与细胞受体表面糖链的特异性结合与流感病毒的宿主范围也密切相关。因此,关于血凝素的研究对揭示病毒感染机制、疾病防治以及疾病监测预警等方面有着重要意义。但目前缺乏快速高效的从病毒液中分离纯化血凝素的方法,同时也有必要发展一种快速判断禽流感宿主特异性的技术。本研究以糖链磁性微粒复合物分离纯化糖结合蛋白技术为基础,对禽流感病毒血凝素进行分离纯化,并根据病毒特异性识别的糖链评估禽流感病毒的宿主范围,判断出其是否直接感染人类。 方法:选用鸡胚培养法对禽流感病毒进行培养,使用红细胞吸附法、T-E提取法、蔗糖丙酮法、乙醚提取法对血凝素进行了粗提并对提取效果进行了比较。选取糖链与羟基化修饰的磁性微粒进行偶联,利用糖链与血凝素的特异性结合,从粗提的血凝素中对其进行进一步分离纯化,对所得到的蛋白进行SDS-PAGE鉴定以及MALDI-TOF进一步鉴定,并根据不同糖链磁性微粒复合物对血凝素的纯化结果评估禽流感病毒的宿主范围。结果:对8种毒株的禽流感病毒进行了鸡胚培养。对四种血凝素的分离纯化方法的比较,并最终选择乙醚提取法作为最终的禽流感病毒血凝素初步提取的方法。对羟基化磁性微粒与寡糖链的偶联条件进行了优化,测定了糖链磁性微粒复合物的稳定性,选定糖链磁性微粒复合物分离纯化血凝素的体系,对禽流感病毒血凝素与糖链磁性微粒复合物结合的特异性进行了验证,空白对照实验进一步验证了结果的可靠性。分别应用唾液酸(SA)α2-3半乳糖(Gal)糖链磁性微粒复合物和SAα2-6 Gal糖链磁性微粒复合物对禽流感A/DK/GD/17/08 (H5N1)、HB7(H7N2)、A/DK/GD/S-7-134/04(H9N2)亚型病毒的血凝素进行了分离纯化,通过SDS-PAGE鉴定结果并评估禽流感宿主特异性,应用MALDI-TOF对提取物进行鉴定,其分子量与禽流感病毒血凝素的分子量相符合。 技术路线:


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