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回转条件下成骨细胞微丝对BMP2信号传导的调控

徐洪杰  
【摘要】:骨丢失是空间飞行期间显著的航天医学问题。为了确保航天员在未来长期飞行任务中健康、高效工作,需要在细胞分子水平阐明空间骨丢失的发生机制。空间骨丢失的主要原因是失重导致的骨形成下降。骨形成受到力学因素和生物因素的调控,但力化学传导机制尚不完全清楚。整合素-微丝骨架系统是细胞主要的力感受传导系统。它能感受机械刺激并将其转化为化学信号,是机械刺激条件下细胞分化调控的核心枢纽。BMPs具有体外诱导成骨和体内促进骨形成的特性,在骨骼修复、重建过程中起关键调节作用。研究表明整合素功能、微丝骨架的聚合动态及张力和微丝结合蛋白调控成骨细胞分化[1-3]。但失重条件下微丝骨架耦联BMP2调控成骨分化的作用及机制至今尚不完全清楚。课题组前期发现回转通过微丝骨架解聚抑制Runx2对BMP2的响应性,在此基础上,该论文聚焦微丝骨架对BMP2信号传导的调控作用,研究回转模拟失重条件下微丝骨架对BMP2激活Smad、促进Smad入核和转录活性、激活Runx2表达的调控作用,并研究微丝结合蛋白calponin1(CNN1)在微丝骨架与BMP2信号传导协同调控中的作用。为揭示成骨细胞力学-生化耦联机制和阐明空间骨丢失的细胞分子机制提供理论和实验依据。实验方法:(1)通过免疫荧光染色观察微丝骨架解聚剂(cytochalasin B,CB)对MC3T3-E1细胞微丝骨架的解聚作用;通过Co-IP和Western blot方法研究CB对BMP2诱导Runx2蛋白表达及其与p-Smad1/5/8相互作用的影响;通过转染反映Smad转录活性的报告基因pBRE-Luc质粒和检测Luc酶活性,研究CB对BMP2诱导Smad转录活性的作用;通过免疫荧光、核质蛋白分离,研究CB对BMP2激活的Smad1/5/8磷酸化及其入核的影响。(2)分析模拟失重效应引起的微丝结合蛋白的表达变化;通过基因过表达和敲低的方法,采用Western blot、Luc酶活性检测和RT-qPCR,研究CNN1对BMP2诱导的Smad1/5/8磷酸化、入核和转录活性的作用以及CNN1磷酸化的变化;利用双向Co-IP技术和免疫荧光染色研究CNN1与Smad蛋白的相互作用及定位;通过构建CNN1蛋白截短体和Co-IP检测CNN1片段与Smad的相互作用。(3)利用回转模拟失重效应,联合BMP2诱导和微丝骨架稳定剂(Jasplakinolide,Jas)的处理,采用Western blot和Luc酶活性检测,研究微丝骨架及CNN1在回转调控BMP2-Smad信号通路中的作用。实验结果:(1)CB能够诱导MC3T3-E1细胞微丝骨架解聚;阻断BMP2诱导的Runx2蛋白表达及其与p-Smad1/5/8形成复合体,显著抑制BMP2对Smad1/5/8激活(5.2倍降到2.0倍)、入核复合体形成、核内累积和Smad转录活性(4.5倍降到2.6倍)的诱导。表明微丝骨架解聚抑制BMP2-Smad信号传导及其靶基因Runx2表达。(2)分析发现回转条件下成骨细胞微丝骨架结合蛋白CNN家族mRNA表达下调;siRNA介导的CNN1敲低使BMP2诱导的Smad1/5/8磷酸化升高到2.5倍、转录活性升高到2.8倍,而CNN1过表达则抑制Smad1/5/8磷酸化。CNN1敲低显著抑制CB对Smad1/5/8磷酸化和转录活性的调控作用。说明微丝骨架解聚通过CNN1抑制BMP2-Smad信号通路。(3)Co-IP结果表明CNN1能与BMP2诱导的Smad结合,并随微丝骨架解聚而增强;基于CNN1蛋白两端和中间三段结构域构建的蛋白片段均可结合Smad1和p-Smad1/5/8。微丝骨架解聚显著抑制CNN1磷酸化(27.2%),使结合肌动蛋白的未磷酸化的CNN1增多;CNN1与Smad在细胞质局部聚集。表明微丝骨架解聚条件下,CNN1与Smad结合增多,阻滞后者于胞质,抑制其在胞膜处磷酸化,抑制激活的Smad入核,从而抑制BMP2-Smad信号传导。(4)MC3T3-E1细胞回转24小时,胞浆内Smad1/5/8磷酸化下降(15%),回转48小时,胞核和胞浆Smad1/5/8磷酸化均显著下调(65.2%和61.9%);回转抑制BMP2诱导的Smad转录活性(61.0%),而Jas使回转条件下Smad转录活性提高69.6%,说明回转通过微丝骨架解聚抑制BMP2-Smad信号传导。上述Jas的作用能被siRNA介导的CNN1敲低阻断,回转抑制CNN1磷酸化,表明回转条件下微丝骨架通过CNN1调控BMP2-Smad信号传导。结论:回转模拟失重诱导微丝骨架解聚,通过肌动蛋白结合蛋白CNN1阻滞Smad的激活与入核,抑制BMP2-Smad信号传导及其靶基因Runx2的表达。


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