调制光学成像原理及其在生物学中的应用

【摘要】：在生物学成像过程中,样品本身的自发荧光和成像过程中显微镜系统产生的随机噪声会导致所采的图像模糊不清。目前基本都是在过表达状态下观察感兴趣的蛋白分子,但是这可能会导致一些负面的结果,影响实验结果的准确性,如细胞毒性和dominant-negative现象,这些缺陷限制了一些低拷贝基因操作技术的应用。然而生理状态下蛋白分子的表达量很低,信号很弱,如何在高背景中检测到我们所需要的微弱信号,一直是人们思考的问题。本文从以下三个方面介绍了一种新颖的光学成像方法——调制光学成像方法。第一部分主要介绍了调制光学成像的原理并介绍了相应的两种解调方法:1、光学锁相解调2、傅里叶变换解调。它是利用两种波长激光之间快速切换来调制发射出的荧光,由于自发荧光和随机噪声不被调制,所以经过解调后可以恢复微弱信号。由于需要对荧光进行调制,所以选择适合的荧光蛋白非常重要,这部分还介绍了rsEGFP2这种光切换蛋白的性质。第二部分主要介绍了全内反射成像系统(TIRFM)的搭建,包括多路激光耦合,多功能荧光照明器的搭建以及使用micromanager软件控制整个显微镜硬件。由于全内反射成像是通过消逝波来进行照明,照明深度只有100nm左右,所以这种照明方式能很大程度抑制离焦的散射光,配合具有检测单个光子能力的电子增益电荷耦合检测器件(EMCCD),整套系统具有非常灵敏的微弱信号检测能力。第三部分主要介绍了使用这两种解调方法分别对Hela细胞中的actin和线虫中的内质网进行成像,比较了各自的优缺点,并讨论了它们的适用条件。