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非标记液晶生物传感器检测人类β防御素-2的方法研究

霍文静  
【摘要】:液晶是一种处于液体和晶体之间的特殊物质状态,兼具液体的流动性和晶体的光学各向异性,因其具有这种物理性质被用作敏感元件来构建液晶生物传感器。液晶传感器主要是利用液晶的双折射特性,通过改变传感器基底膜的组装情况来控制液晶分子的取向,使得其在偏光显微镜下显示出不同的光学信号,进而达到检测目标物的目的。对比与其他检测方法,该方法具有构造简单、成本低、无需标记,响应快速、所呈现的光学信号肉眼可观等优点,在生物检测方面具有潜在应用价值,目前液晶生物传感器在生物分子的分析检测领域已有涉及。本课题结合液晶生物传感器的优势,将其应用到人类β防御素-2的检测,并对如何降低该方法的检测限做了一定的研究和探讨,具体研究内容和结果如下:1、基于硅烷化试剂自组装膜法制备传感器基底。传感器基底经过3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)/二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(DMOAP)混合醇溶液组装氨基化膜,再利用戊二醛(GA)对组装膜进行醛基化修饰用以偶联生物分子。用原子力显微镜和接触角测量结果表征基底组装情况,制成液晶池后通过偏光显微镜观察图像,根据图像的明暗程度判断液晶分子的取向。最终结果显示:当APTES与DMOAP体积比为3:1,GA含量为2%时,光学图像为均一的黑色图案,不会产生背景干扰。2、基于直接免疫反应构建液晶生物传感器用以检测HBD-2。GA上的一个醛基与HBD-2抗体上的氨基反应,从而将HBD-2抗体固定在制备好的传感器基底膜上。当固定在基底表面的HBD-2抗体与一定浓度范围内的HBD-2特异性结合后,基底表面形貌发生变化,引起液晶分子的排列取向的变化,导致光学信号发生变化,以此实现对HBD-2的检测。当HBD-2的含量高于5.0 ng·mL~(-1)时,可观测到明显的光学图像变化,当HBD-2浓度在5~150 ng·mL~(-1)范围内时,光学图像的平均灰度强度与HBD-2浓度具有良好的线性关系,线性方程为:线性相关系数R~2为0.9989,HBD-2的检测限为4.95 ng·mL~(-1)。3、基于竞争免疫反应构建液晶生物传感器用以检测HBD-2。GA上的一个醛基与HBD-2上的氨基反应,从而将HBD-2固定在制备好的传感器基底膜上。固定在基底表面的HBD-2与样品中的待测HBD-2竞争结合HBD-2抗体的结合位点,随着待测样中HBD-2的变化,结合至基底表面的HBD-2抗体的量会发生变化,从而基底表面形貌发生变化,引起液晶分子的排列取向的变化,导致光学信号发生变化,以此实现对HBD-2的检测。当HBD-2浓度在1~10 ng·mL~(-1)范围内时,光学图像的平均灰度强度与HBD-2浓度具有良好的线性关系,线性方程为:,线性相关系数R~2为0.9956,HBD-2的检测限为0.53 ng·mL~(-1)。4、纳米金-HBD-2抗体复合物的制备。主要采用柠檬酸钠还原法制备了尺寸大小别为13 nm的纳米金,优化了AuNPs-HBD-2抗体复合物的制备条件。采用紫外一可见吸收光谱、透射电子显微镜和纳米粒径分析方法对所合成的纳米金以及AuNPs-HBD-2抗体复合物进行表征。结果表明所合成的纳米金稳定均匀,制备的AuNPs-HBD-2抗体性质稳定,为后续制备一种基于纳米金信号放大的液晶生物传感器检测HBD-2奠定了基础。


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