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转人β防御素3基因克隆牛的研制及检测

马会明  
【摘要】:?本试验研究分别从DNA、RNA和蛋白水平检测出发,通过载体鉴定、细胞筛选、阳性细胞株鉴定,采用优化的转基因克隆的方法生产转基因牛,并对生产的转基因牛外源基因整合位点和拷贝数等鉴定方法确定转基因克隆牛外源基因整合的准确性,从而为转基因克隆牛进一步生产研究奠定基础。 ⑴乳腺上皮细胞分离纯化、鉴定及转染 试验通过组织块贴壁培养和差速分离纯化的方法分离得到生物学特性正常的乳腺上皮细胞,转染前后的细胞周期和细胞核型没有变化,正常分泌β-酪蛋白。电穿孔转染后,经过600μg/mL的G418筛选,得到生物学特征正常的阳性细胞株,hBD3蛋白和EGFP蛋白表达正确,可以进行进一步鉴定生物学活性。 ⑵乳腺上皮细胞阳性细胞株抑菌活性分析 试验中用southern blot方法鉴定乳腺上皮细胞阳性细胞株有外源基因整合。添加100nM的组胺时分泌上清中人防御素3蛋白含量明显增高。采用琼脂扩散法和液体细菌生长抑制试验测定分泌的上清的体外抑菌活性,结果显示对大肠杆菌、葡萄球菌,无乳链球菌、停乳链球菌和化脓链球菌都有抑菌作用。 ⑶核移植生产转基因克隆牛 试验中活体采集卵母细胞提高卵母细胞成熟率(94.6% vs 82.2%)和囊胚发育率(37.7% vs 28.4%);试验中添加浓度为50μM的半胱胺,明显提高成熟效率(89.9% vs 82.7%)和囊胚发育率(42.2% vs 33.5%)。试验中使用第2代至第4代的成纤维阳性细胞提高卵裂率和囊胚率;使用G1期和G0/G1期成纤维阳性细胞卵裂率(78.9% vs 82.4%)和囊胚率(26.8% vs 33.3%)没有明显差异,在胎儿出生率上有明显差异(20.6% vs 13.2%)。结果表明,利用活体采卵方法和添加半胱胺可以保证卵母细胞质量,提高卵母细胞成熟率和囊胚发育率,使用G0/G1期细胞做核移植可以提高胎儿出生率,最后获得了20头转人β防御素3基因克隆奶牛。 ⑷转基因克隆牛的检测 试验通过southern blot杂交鉴定转基因克隆牛外源基因已经整合到基因组。绝对定量PCR法检测外源基因的拷贝数,检测结果显示外源基因拷贝数为1。反向PCR法确定了转基因克隆牛整合位点两端676bp大小的侧翼序列,位于牛4号染色体上1676325-1676638,1676722-1677079位置,与牛基因组中NW_001494934.2基因序列部分序列同源,序列同源性为89%,插入位点上游基因为牛T细胞受体γC4(TRG C4)和氮(α)-乙酰转移酶38(NAA38),下游没有功能基因。 以上结果表明,实验所用的载体通过乳腺上皮阳性细胞株验证有抗菌功能,转基因克隆牛多以单拷贝在基因组整合,这些检测及鉴定为继续研究转基因克隆牛的遗传和表达稳定性建立了牢固基础。


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