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辅酶Q_(10)高产菌株选育及发酵过程优化研究

田玉庭  
【摘要】:辅酶Q_(10)是一种重要的生化药剂,临床上被广泛应用于心血管疾病的治疗。此外,辅酶Q_(10)因具备抗氧化性和消除自由基的功能,而今已扩展到食品和化妆品领域。当前,辅酶Q_(10)制备方法主要有化学法、动植物组织提取法和微生物发酵法。与前两种制备方法相比,微生物发酵合成辅酶Q_(10)具有成本低、无光学异构体及生物学活性高等特点,因而被认为是最具前途的生产方式。本研究以根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为出发菌株,诱变育种结合定向筛选,成功获得一株高产辅酶Q_(10)突变株,后通过发酵过程优化控制,最大限度的发挥该突变株代谢合成辅酶Q_(10)的特性。主要研究内容和结果如下: (1)系统考察超声波破碎法、反复冻融法、研磨法、酸热法对根癌土壤杆菌细胞破碎和辅酶Q_(10)提取效果的影响。结果表明,酸热破碎法提取辅酶Q_(10)效果最好;其中,以盐酸破壁提取效果最佳,乳酸和硫酸次之。酸热破壁提取工艺的关键因子为:料液比、破壁温度和处理时间。中心组合设计和响应面分析结果显示,在3 mol/L盐酸处理条件下,酸热破壁提取最佳工艺参数为:料液比10.8 mL/g、破壁温度84.2°C、处理时间35.3 min。在最佳破壁工艺下,辅酶Q_(10)提取量能达到1.518 mg/g。 (2)以根癌土壤杆菌1.2554为出发菌株,经高静水压诱变处理,筛选获得一株呼吸链抑制剂NaN3抗性突变株PN07。菌株PN07后经过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变,获得一株酪氨酸缺陷型突变株MT18。菌株MT18后经高静水压、紫外线和硫酸二乙酯交替诱变,采用抗结构类似物(乙基硫氨酸、柔红霉素、维生素K_3)的抗性平板初筛,经摇瓶发酵复筛,最终获得一株辅酶Q_(10)高产菌株PK38,其胞内辅酶Q_(10)含量达2.30 mg/g干菌,较出发菌株提高51.51%。菌株PK38后经10次传代培养,辅酶Q_(10)含量无明显下降,表明PK38是一株遗传性状稳定的优良菌株。 (3)采用单因素试验并结合Plackett-Burman试验设计,筛选出影响PK38细胞生长和辅酶Q_(10)产量的重要因子为:蔗糖、玉米浆干粉、硫酸铵、硫酸镁、生物素和茄尼醇。结合Box-Behnken设计和响应面分析,得到生产辅酶Q_(10)的最佳发酵培养基配方为:蔗糖37.2 g/L、玉米浆干粉37.1 g/L、硫酸铵7.0 g/L、硫酸镁0.4 g/L、生物素82.9μg/L、茄尼醇0.2 g/L、CaCl_2 140 mg/L、FeSO_4·7H_2O 0.2 mg/L、ZnSO_4·7H_2O 8 mg/L、烟酸8 mg/L。在最佳发酵培养基下摇瓶发酵72 h,生物量和辅酶Q_(10)产量分别可达到9.25 g/L和28.44 mg/L。 (4)采用摇瓶发酵试验,利用单因素试验考察了初始pH值、发酵温度、接种量和发酵时间对PK38细胞生长和发酵生产辅酶Q_(10)的影响。结果表明,辅酶Q_(10)发酵最佳初始pH值、发酵温度、接种量和发酵时间分别为:7.2、30°C、8%和72 h。后利用5 L发酵罐,研究转速和溶氧浓度对辅酶Q_(10)发酵的影响。结果表明,较高转速和溶氧浓度有利于细胞生长,但不利于PK38胞内辅酶Q_(10)的代谢合成。后经采用分段控制溶氧工艺(0-36 h为90-100%,36-72 h为30%),最终辅酶Q_(10)产量为56.46 mg/L,比最优恒定转速下提高11.71%。 (5)基于Logistic方程、Leudeking-Piret方程以及Luedeking-Piret-like方程得到了描述辅酶Q_(10)分批发酵过程的动力学模型和模型参数。经模型检验,结果表明,在蔗糖浓度为30 ~ 40 g/L范围内,该组模型适应性良好,能较好地拟合发酵过程,可反映菌株PK38分批发酵过程的动力学特征。 (6)基于分批发酵动力学模型,以蔗糖为单一流加底物,分别考察了分批补料培养、恒速流加培养(高速、低速)和指数流加培养3种培养模式下,菌株PK38发酵生产辅酶Q_(10)的代谢特征。结果表明,指数流加培养策略为菌株PK38发酵生产辅酶Q_(10)最佳培养模式。该培养模式下,PK38最终生物量和辅酶Q_(10)产量分别达32.37 g/L和120.01 mg/L,与分批发酵相比,分别提高了126.11%和173.12%。


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