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新型大白菜Ogura细胞质雄性不育系RC_7不育机理研究

赵会芳  
【摘要】:大白菜原产我国,具有明显的杂种优势,而细胞质雄性不育(CMS)又是大白菜杂种一代优势利用最重要的途径。本研究从花器形态学、花药发育过程的显微结构和超微结构、同工酶、生理生化以及基因表达等不同水平对大白菜萝卜细胞质雄性不育系RC_7及其保持系进行了研究,以期揭示大白菜雄性不育RC_7的不育机理。本论文取得的主要研究成果如下: 1.花器形态观察表明:不育系RC_7花朵开张度和花瓣长(宽)度、花萼、花药、药丝均小于保持系B_7,柱头与子房略大于保持系,成熟花药不开裂或者部分开裂没有花粉,雌蕊发育正常,蜜腺发育正常。细胞形态学研究表明,供试大白菜雄性不育材料RC_7和保持系B7的小孢子母细胞减数分裂属同时型,小孢子在四分体中的排列属四面体型,保持系大白菜花药的绒毡层属于腺质型。不育材料RC_7在四分体时期出现败育征兆,单核期开始败育,属于单核花粉败育型。败育原因可能是绒毡层细胞液泡化和径向肥大,小孢子受挤压后破裂降解,不能形成正常的成熟花粉粒。 2.利用戊二醛和锇酸双染技术对不育系和保持系花药发育过程进行超微结构观察,结构表明:不育系RC_7四分体及四分体时期之前初生外壁的沉积正常,孢粉素的沉积也是正常的;四分体后到单核期,孢粉素的锚定开始反常,孢粉素的沉积不连续,导致花粉外壁的柱状层低矮、廋小。RC_7四分体时期绒毡层细胞中可观察到一些较大的液泡,当胼胝质降解,小孢子游离出来后,绒毡层细胞异常液泡化。单核晚期,绒毡层细胞完全降解,花粉败育。保持系B_7单核小孢子晚期,绒毡层细胞内出现大量脂滴,二核细胞早期,绒毡层细胞中布满由多个小圆球体组成的造油体。当绒毡层细胞裂解后,这些脂质和蛋白质释放到小孢子表面,形成花粉外被。 3.通过测定不育系及其保持系叶片、花蕾中抗氧化物酶活性,研究了胞质雄性不育与活性氧代谢的关系。结果表明:不育系花蕾的O_2~-.产生速率、H_2O_2和MDA含量,均高于保持系,SOD活性不育系高于相应的保持系,单核期和花粉粒成熟期不育系中POD活性高于相应的保持系。不育系CAT活性则低于相应的保持系。APX活性是单核期和单核期之前不育系高于相应的保持系,而花粉粒成熟期则明显低于相应的保持系。蕾期叶片测定结果表明,O_2~-.产生速率、H_2O_2、MDA含量、POD和SOD均是不育系高于保持系,表明大白菜雄性不育系RC7的败育特征在其叶片中亦有所表现。 4.对不育系和保持系六叶期、莲座期、蕾期叶片及小孢子发育过程中花蕾的可溶性糖、还原糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量进行比较研究,结果表明:大白菜营养生长期,不育系和保持系叶片中可溶性糖、还原糖及可溶性蛋白含量均无显著差异。在小孢子发育过程中,可溶性糖、还原糖、可溶性蛋白含量均明显低于保持系。不育系六叶期,蕾期叶片及小花蕾时期脯氨酸含量均高于保持系,莲座期和单核期、花粉粒成熟期脯氨酸含量小于保持系。小孢子的发育过程中,不育系花蕾中脯氨酸呈下降趋势,保持系中脯氨酸含量呈上升趋势,因而不育系花蕾的脯氨酸含量在花粉粒成熟期明显低于保持系。 5.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,研究了不育系RC_7及其保持系蕾期小孢子发育过程中过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、酯酶(EST)、淀粉酶(AMY)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、超氧化物歧化酶(SOD)等同工酶酶谱的变化。同工酶分析表明,RC_7不育系的POD和AMY同工酶酶谱在小孢子发育的整个时期与保持系B_7都存在明显差异,且CAT和EST同工酶酶谱在花粉粒成熟时期比保持系B_7少了2条清晰的谱带,酶谱差异表达时期与细胞学上观察到的败育时期一致。ATP同工酶酶谱保持系的酶带数多于不育系,两系的ATP同工酶酶谱在小孢子发育的整个过程中都存在明显差异。SOD同工酶在不育系和保持系间无明显差异。 6.利用cDNA-AFLP差显技术比较分析了不育系RC_7及其保持系蕾期基因的表达差异,用反向Northern杂交筛选阳性克隆片段,获得了23条阳性差异转录片段,其中在不育系花蕾中特异表达的有11条,在保持系花蕾中特异表达有10条,两系中共有2条。对11条在不育系中特异表达的谱带进行BLAST搜索发现,H1与拟南芥光合反应蛋白基因有较高的相似性,H26与拟南芥钙调磷酸酶类磷酸酯酶家族蛋白质的部分序列存在90%的相似性,属于细胞信号转导基因。对来自保持系中能找到同源序列的10条TDFs的功能以及同源性进行BLAST比对分类的结果发现,它们包括糖代谢、蛋白质的合成与运输、乙烯诱导基因、电子传递和能量途径、未知或假定蛋白等。登录了其中18个,登录号为:GT968773,GT968786,GT968787,GT968788,GT968789,GT968790,GT968774,GT968775,GT968776,GT968777,GT968778,GT968779,GT968780,GT968781,GT968782,GT968783,GT968784,GT968785。 7.获得一个育性相关的新基因。以一个用cDNA-AFLP分析大白菜雄性不育系和保持系花蕾得到的差异表达片段(TDF,Transcript Derived Fragments)EST H9为信息探针,在GenBank数据库中进行同源EST序列检索,并对亲缘关系近的同源EST序列进行拼接,得到大白菜EST H9的5′cDNA序列。根据拼接组装所得的5′的cDNA序列,进行3′RACE引物的设计,经RACE-PCR扩增、测序,获得了大白菜α-碳酸酐酶3基因的cDNA全长序列并已将其登录到GenBank(登录号:GU143061),命名为BrACA3。该cDNA全长998 bp,编码270个氨基酸。同源分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与拟南芥α-碳酸酐酶3同源性78%。氨基酸序列分析表明,该蛋白具备跨膜功能,在19和20之间存在一个信号肽序列,存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点。在大白菜花蕾败育过程中α-碳酸酐酶3基因不表达,只在保持系B_7的花粉粒成熟期花蕾中表达。


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