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中国华东葡萄抗白粉病芪合成酶基因及启动子克隆与功能分析

徐伟荣  
【摘要】:葡萄白粉病[Uncinula necator (Schw.) Burr.]是严重为害世界葡萄生产的一种真菌病害。在世界范围内广泛栽培的欧洲葡萄品种,虽然品质优良,但对白粉病抗性普遍较差。中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)作为高抗白粉病的野生葡萄资源被多次报道。葡萄白藜芦醇是苯丙氨酸合成途径中芪合成酶基因的表达产物,它不仅能增强植物的抗病性,而且具有抗癌、抗肿瘤、预防心血管疾病与神经保护剂等保健功能。本研究选用抗白粉病葡萄种质中国野生华东葡萄白河-35~(-1)、感白粉病葡萄品种佳利酿与无核白为材料,研究了芪合成酶基因在葡萄与白粉菌互作过程的表达变化模式;比较了葡萄不同基因型中芪合成酶基因组结构;克隆了芪合成酶基因上游调控序列;应用农杆菌介导的模式植物烟草瞬时表达系统分析了获得的启动子活性;并检测了芪合成酶基因在病原菌诱导下的烟草中白藜芦醇的含量,主要结果如下: 1.研究了在葡萄白粉菌接种后抗性种质中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)与感病欧洲葡萄品种佳利酿、无核白芪合成酶基因的表达模式。在与白粉菌互作过程中,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因的表达模式不同于感病欧洲葡萄品种,在与白粉菌互作的早期表现为抑制表达,而在后期呈现增强表达的模式;进一步的分析表明,在这种特异的表达模式中涉及两类芪合成酶基因的协调表达,而在感病欧洲葡萄品种佳利酿、无核白中仅发现1类芪合成酶基因的表达。 2.从中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)、欧洲葡萄佳利酿、无核白基因组中,分别克隆了2个具有开放阅读框的芪合成酶基因,GenBank登录号分别为FJ830329,FJ830330,FJ851182,FJ851183,FJ851184与FJ851185。比较分析发现抗病种质与感病品种芪合成酶基因序列同源性为94-99%;对获得的芪合成酶基因组序列结构分析表明,所克隆的基因均包含2个外显子与1个内含子。2个外显子区在抗感基因型中主要为单核苷酸多态性的差异,而内含子区域的插入、缺失变异较大。酶切分析表明,所克隆的6个芪合成酶基因组可分为两种类型。推导的氨基酸序列与已报道的葡萄属植物芪合成酶同源性为94.5-99.5%,而且具有不同于查尔酮合成酶的“IPNSAGAIAGN”与“GVLFGFGPGLT”特征序列,进一步证明所克隆的序列为芪合成酶基因。 3.应用染色步移法克隆了抗白粉病和感白粉病葡萄基因型中芪合成酶基因的上游调控序列3个,GenBank登录号分别是FJ605484,GU269272与GU269273;通过预测分析发现,这3个上游序列中具有与病原菌及非生物胁迫相关的顺式作用元件。核苷酸比对表明,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因上游调控序列与欧洲葡萄佳利酿、无核白芪合成酶上游调控序列同源性分别为53%与51.7%,而欧洲葡萄品种佳利酿与无核白STS上游调控序列同源性为93.4%;中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因上游调控序列不仅与欧洲葡萄品种芪合成酶上游调控序列同源性差异较大,而且顺式作用元件的种类、数目与分布也差异较大。 4.构建了3个芪合成酶上游调控序列与GUS报告基因融合载体,应用Real-time PCR技术分析了不同融合构建渗透后的烟草叶片在接种烟草赤星病后GUS基因的表达模式。结果表明,在接种后不同时间段中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶上游调控序列驱动的GUS基因的表达模式与2个欧洲葡萄芪合成酶上游调控序列驱动的GUS基因的表达模式差异较大;而2个欧洲葡萄芪合成酶上游调控序列驱动的GUS基因的表达模式相似;与未接种对照叶片的比较,所克隆的3个芪合成酶上游调控序列均具有病原菌诱导活性。通过GUS组织化学与荧光定量分析了不同融合构建对病原菌的响应,结果发现,欧洲葡萄无核白芪合成酶基因启动子的活性最高,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子活性次之,佳利酿芪合成酶启动子活性最低;在非生物胁迫损伤处理及MeJA处理的烟草叶片中,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子对损伤诱导呈现负调控表达,而对MeJA处理响应变化无明显变化;欧洲葡萄佳利酿、无核白芪合成酶启动子对损伤及MeJA诱导均有正调控表达的特性。 5.基于中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子不同于欧洲葡萄的表达特性,进一步对其启动子进行5’端缺失分析。以欧洲感病品种佳利酿无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导的真空渗透法对缺失构建进行GUS活性分析;同时也在异源体系烟草组织中进行了验证。结果表明,1772bp的中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶基因启动子在同源及异源体系中对病原真菌诱导均具有较高的诱导表达特性。不同缺失构建对SA诱导响应中,162bp的启动子区域的诱导活性较高;低温处理时,1129bp启动子区域的诱导表达活性最高。以上结果表明,在所克隆的1772bp的中国野生花葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子序列中,响应病原菌与非生物胁迫的正负调控顺式作用元件共存于该启动子区,包含162bp的启动子区域具有组成型表达特性。 6.构建了3个芪合成酶启动子与芪合成酶基因融合的载体,通过农杆菌介导的烟草瞬时转化法并结合HPLC分析了不同构建转化烟草在接种与未接种赤星病烟草叶片中白藜芦醇的含量。结果表明,中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子与中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶gDNA-2融合的构建转化烟草在接种赤星病后的白藜芦醇含量最高为2.81μg.g~(-1)FW,这一水平是未接种的3.37倍;欧洲葡萄佳利酿芪合成酶启动子与两个芪合成酶gDNA~(-1)、gDNA-2融合的构建转化烟草叶片接种赤星病后的白藜芦醇分别为2.29μg.g~(-1)FW与2.28μg.g~(-1)FW,均为未接种的叶片中白藜芦醇含量的1.82倍;欧洲葡萄无核白芪合成酶启动子与两个芪合成酶gDNA~(-1)、gDNA-2融合的构建转化烟草叶片接种赤星病后的白藜芦醇分别为1.78μg.g~(-1)FW与1.83μg.g~(-1)FW,分别为未接种的叶片中白藜芦醇含量的1.53与1.51倍;而中国野生华东葡萄株系白河-35~(-1)芪合成酶启动子与其2个cDNA与gDNA~(-1)融合的构建转化烟草后白藜芦醇的含量分别为1.06μg.g~(-1)FW与0.84μg.g~(-1)FW与0.67μg.g~(-1)FW,分别为未接种赤星病烟草叶片中白藜芦醇含量的1.68,1.31与1.1倍,结果表明,芪合成酶基因的表达受基因自身及其启动子共同调节作用。


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