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簇毛麦低分子量谷蛋白基因克隆、染色体定位及体外功能鉴定

王延鹏  
【摘要】:低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)是小麦麦谷蛋白中的重要组成部分,含量占籽粒贮藏蛋白的40%。它们通过分子内和分子间二硫键与高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)形成大聚合体,共同决定小麦面粉的加工品质,赋予面筋延展性。与高分子量谷蛋白相比,低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的研究主要集中于一些品质较好的普通小麦上,而由于近年育种节奏加快,使LMW-GS基因的突变范围变小,而且很多结果多是等位基因与加工品质之间关系的研究,而对单个低分子量谷蛋白亚基功能的研究很少。 为了研究小麦近缘种属中LMW-GS基因的变异新类型,以及其亚基对品质的效应,本实验利用LMW-GS特异引物,从簇毛麦叶片基因组中克隆得到3条新类型的低分子量谷蛋白基因完整编码序列,并对其分别构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达这二个基因,利用亲和纯化法纯化目的蛋白,通过氧化-还原反应将亚基整合到基础面粉中做掺粉实验,研究其功能。结果如下: 1.克隆了簇毛麦3条低分子量谷蛋白亚基基因(GenBank登录号分HQ293219, HQ293220, HQ29322),命名为LMW-DV1,LMW-DV12,LME-DV15,所有基因具有完整编码区,长度为831到846之间,可编码277和282个氨基酸残基,与GenBank提供的低分子量谷蛋白基因序列具有一定的同源性,确定这些基因为低分子量谷蛋白亚基基因,但LMW-DV1在阅读框中出现了终止密码子,将其推测为假基因。此外,这三个基因都有完整的启动子结构,且包含麦类作物蛋白特有的胚乳框。 2.序列分析显示,翻译后的氨基酸序列都具有典型的LMW-GS结构:含一个由20个氨基酸组成的N-端信号肽;N-端保守区,N-端重复区,C-端重复区。而本研究所克隆的三个基因编码的蛋白序列都缺少一段N-端保守区,且N-端则直接以重复区开始(QQQLPQQP);序列中共含有8个典型的半胱氨酸残基。经过与小麦种的15个LMW-GS基因序列比对,鉴定出这三个LMW-GS的SNP位点。 3.通过特异SNP分析,设计出簇毛麦LMW-GS的特异引物,利用中国春-簇毛麦的附加系和易位系,将簇毛麦LMW-DV12和LMW-DV15定位在1VS上,而LMW-DV1的定位存在争议,需进一步研究。 4.构建LMW-DV12和LMW-DV15两个基因个片段的Trx融合表达载体,分别在宿主菌E. coli Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE及Western-blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功。 5.采用亲和层析法分离纯化融合蛋白,得到单一的条带,证明纯化效果较好。 6.用纯化样做掺粉实验,两种蛋白的加入使面团特性产生了很大的影响,结果证明簇毛麦的LMW-GS对面团的特性具有正效应。 本实验以簇毛麦TA2127为研究材料,研究了簇毛麦LMW-GS基因的结构特征,构建了低分子量谷蛋白亚基基因的表达载体,在原核表达系统成功实现了这两个基因的融合表达,并对单个亚基的功能进行了研究。该实验结果丰富了小麦LMW-GS基因的类型,以及为改良小麦的品质研究提供了潜在的参考价值,并为单个LMW-GS的体外研究奠定基础。


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